iScience：框架核酸荧光寿命探针追踪自噬过程中的溶酶体pH和Ca2+

注：文末有本文科研思路分析

溶酶体是主要的酸性细胞器，可以调节细胞的各种生理过程，包括蛋白质消化和传递引发的细胞代谢、溶酶体和自噬体融合引发的自噬、组织蛋白酶调控的凋亡行为等。溶酶体功能障碍不仅是常见神经退行性疾病和衰老的重要病理基础，溶酶体中pH和Ca²⁺的变化在溶酶体介导的生理和病理过程中也起重要作用。在生理条件下，溶酶体内pH值在4.5左右，这种酸性环境可以维持质子梯度，进而影响溶酶体膜对不同离子（如Ca²⁺）的渗透性。同时，酸性环境也调节了溶酶体活性，影响自噬溶酶体的形成。更重要的是，溶酶体是细胞中重要的“钙库”，在维持Ca²⁺稳态以及信号转导中起着重要作用。例如，溶酶体中Ca²⁺浓度的过度降低会导致溶酶体功能障碍，从而导致细胞摄取和排泄功能异常，进一步引发自噬异常和衰老。因此，同时监测溶酶体内pH和Ca²⁺含量的实时动态变化具有重要意义。

近日，华东师范大学的田阳教授课题组成功设计并制备了一种基于荧光寿命的DNA纳米探针，实现细胞溶酶体中pH和Ca²⁺高准确、高灵敏的定量分析和实时成像研究。

图1. DNA纳米探针工作原理示意图。

作者首先合成制备了一种荧光Ca²⁺探针（CaL），并与pH响应分子（RhB）和溶酶体靶向分子（MP）一起组装到DNA纳米结构上形成了DNA纳米传感器。基于荧光寿命是荧光分子本质属性的优势，其不受探针浓度、荧光强度和光漂泊的影响，利用制备的DNA荧光寿命探针实现了单个神经细胞中溶酶体内pH和Ca²⁺的实时成像和生物传感研究。得益于该探针具有的高准确度、优异的荧光和结构稳定性和荧光寿命成像技术的高空间分辨率，成功准确地量化Aβ和Rapa刺激下溶酶体内pH和Ca²⁺变化动力学，发现溶酶体内的pH值和Ca²⁺浓度密切相关，并且可以共同作用来调节自噬水平。此外，还发现Aβ诱导的细胞死亡是由溶酶体内的pH和Ca²⁺调控的自噬异常的结果。基于上述结论，作者进一步利用溶酶体的pH和Ca²⁺调控细胞衰老，发现调节溶酶体pH和Ca²⁺可以影响细胞自噬水平，进而影响静止神经干细胞的活化，起到调控细胞衰老的作用。该工作为框架核酸纳米探针的设计及应用提供新方法、新思路。

图2. Aβ诱导刺激下神经元溶酶体内pH和Ca²⁺的实时荧光寿命成像

这一成果近期发表在Cell出版集团期刊iScience上，文章的第一作者是华东师范大学博士研究生张中惠，通讯作者为华东师范大学田阳教授和刘智超博士。

原文：

https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(20)30531-9

A DNA-based FLIM reporter for simultaneous quantification of lysosomal pH and Ca²⁺ during autophagy regulating

Zhonghui Zhang, Zhichao Liu*, Yang Tian*

iScience, 2020, DOI: 10.1016/j.isci.2020.101344

导师介绍

田阳

https://www.x-mol.com/university/faculty/49547

课题组主页

http://yangtian.chem.ecnu.edu.cn/index.aspx

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：我们课题组一直致力于氧化应激密切相关物质的分析新方法的研究和建立。针对脑环境测定复杂、干扰众多、物质相互转换、体内外测定环境差异大等关键科学问题，我们建立了一系列用于鼠脑和神经元中氧化应激密切相关金属离子、活性氧、蛋白质等物质的高选择性、高灵敏度、高准确度的分析新方法(Angew. Chem. Int. Ed., 2020, 59, 10426; J. Am. Chem. Soc., 2020, 142, 7532; Chem. Sci., 2020, 11, 2215; Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58, 5256; Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58, 13948; Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56, 10471; Angew. Chem. Int. Ed., 2015, 127, 14259)。此外，我们最近还发展了一种用于检测线粒体内pH和Ca²⁺的比率型荧光探针(ACS Nano., 2018, 12, 12357)。基于以上研究，我们发现pH和Ca²⁺对于分析氧化应激等疾病具有重要研究意义。而溶酶体作为细胞内重要的酸性细胞器和“钙库”，pH和Ca²⁺的变化在溶酶体介导的生理和病理过程（如自噬）起重要作用。然而，目前仍缺乏有效的方法来实现溶酶体内pH和Ca²⁺的直接定量检测。因此，发展一种新方法用于溶酶体内pH和Ca²⁺的实时定量检测分析对于理解相关的生理病理过程具有重要意义。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：该研究中最大的挑战主要体现在三点：（1）如何合理地构筑双检测分析体系，避免双分子识别信号的交叉干扰，同时解决测定中高选择性、高灵敏度、高准确度，是本课题的挑战之一；（2）由于溶酶体很小，约0.5 μm，如何实现对于溶酶体内pH和Ca²⁺的高空间分辨成像的挑战；（3）由于溶酶体具有很强的消化降解能力，因此探针的稳定性也是重要的挑战。