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Nature Chem.:雷晓光/戴均贵/黄璐琦合作发现自然界中首例“真正意义”的分子间DA反应酶

狄尔斯-阿尔德反应(Diels-Alder reaction,简称“DA反应”)是共轭双烯(二烯体)与取代烯烃(一般称为亲双烯体)之间发生的[4+2]环加成反应,也是合成化学中构建C-C键最常用的方法之一,被广泛应用在天然产物和药物分子的合成中,如图1所示(Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41, 1668-1698)。


图1. DA反应在复杂天然产物和药物分子合成中的代表性应用。DA反应可以用于构建环己烯骨架结构,该结构还可以继续被官能团化从而转化为新的骨架。图中红色结构部分的构造涉及到DA反应。


虽然Diels-Alder反应有着广泛的应用,如何控制Diels-Alder反应中的区域、非对映以及立体选择性仍然是化学家们面对的重要挑战。由于酶催化具有反应速度快、选择性高的特点,开发出基于酶催化的不对称Diels-Alder反应在化学合成上具有重要的应用价值。自1928年,德国化学家Otto Diels和他的学生Kurt Alder首次报道了DA反应(Justus Liebigs Ann. Chem., 1928, 460, 98-122),他们就推测很多天然产物可以通过DA反应来构建,暗示了在自然界可能存在催化该反应的酶:Diels-Alder反应酶(Diels-Alderase)。不过到目前为止,科学界发现的Diels-Alderase并不多,以催化分子内DA反应为主,能催化分子间DA反应的酶更是屈指可数,并且这有限几种分子间Diels-Alderase并不是只催化分子间DA反应,还催化其他化学反应。那么,自然界中是否存在“真正意义”的分子间DA反应酶?


2020年5月25日,北京大学化学与分子工程学院雷晓光课题组、中国医学科学院药物研究所戴均贵课题组以及中国中医科学院黄璐琦课题组合作,在Nature Chemistry 杂志上发表论文,报道了自然界中存在的首例催化分子间Diels-Alder反应的单功能酶,为这个多年来的重要科学争论画上了句号。


在自然界中存在很多包含环己烯骨架的天然产物,这类天然产物中的环己烯骨架在生源上被认为由酶催化的DA反应构建。目前为止,已发现能催化DA反应进行的Diels-Alderase并不多,且以催化分子内DA反应为主。第一例单功能的Diels-Alderase是美国德克萨斯大学奥斯汀分校的刘鸿文教授课题组报道的催化分子内[4+2]环化反应的SpnF(Nature, 2011, 473, 109-112)。此后,中科院上海有机所的刘文教授课题组报道了在pyrroindomycins生物合成过程中催化分子内[4+2]环加成反应的PyrE3和PyrI4(Nat. Chem. Biol., 2015, 11, 259-265)。日本东京大学的Tomohisa Kuzuyama课题组(J. Am. Chem. Soc., 2015, 137, 572–575)以及英国布里斯托大学的Paul R. Race课题组(J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 6095–6098)也分别报道了另外两个参与螺环结构形成的分子内Diels-Alderase。UCLA的唐奕课题组(J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 15837-15840; J. Am. Chem. Soc., 2018, 140, 2067-2071; J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 769-773; J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 5659-5663)以及日本理化研究所的Naoki Kato课题组(Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57, 9754-9758)还报道了在萘烷结构形成的过程中催化分子内DA反应的Diels-Alderase。在研究Vinblastine及其相关生物碱的生物合成过程中,马克斯普朗克化学生态研究的Sarah O’Connor课题组发现一类水解酶家族的蛋白能够催化分子内[4+2]环化反应并控制其区域选择性,从而生成不同结构的产物(Science, 2018, 360, 1235-1239; J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 12979−12983; Nat. Chem. Biol., 2020, 16, 383-386)。唐奕课题组以及UIUC的Wilfred A van der Donk课题组还分别报道了催化分子内杂原子参与的[4+2]环加成反应的LepI(Nature, 2017, 549, 502-506,点击阅读详细)和TbtD(J. Am. Chem. Soc., 2015, 137, 16012-16015)。除此之外,催化分子内[6+4]环加成反应的环化酶也被南京大学戈惠明教授与合作者共同报道(Nature, 2019, 568, 122-126,点击阅读详细)。


虽然催化分子内DA反应的酶已有一定的研究,但能催化分子间DA反应的酶非常有限,仅有macrophomate 合成酶(Nature, 2003, 422, 185-189)和riboflavin 合成酶(J. Am. Chem. Soc., 2010, 132, 2983-2990)以及协和药物所胡友财研究员课题组最新发现的催化分子间氧杂Diels-Alder 反应的EupfF(J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 14052−14056)。这三个分子间Diels-Alderase除了催化[4+2]环化外,还催化着其他的化学转化,因此这些酶均属于多功能Diels-Alderase。随着对反应机理研究的深入,有些Diels-Alderase被发现并不是通过催化协同的DA反应机理来构建天然产物中的C-C键。例如,越来越多的证据表明macrophomate 合成酶并不是一个分子间DA反应酶,而是一个缩醛酶,它通过分步催化Michael加成和Aldol反应而不是DA反应实现两个C-C键的构建(J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 3577-3588; J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 25, 7798-7799)。从最初DA反应的发现,到目前为止超过了90多年,还没有“真正意义”催化分子间DA反应的单功能的Diels-Alderase从自然界中被发现。

图2. 桑树中代表性D-A类型天然产物(a)及其推测的生源合成途径(b)以及研究策略(c)。图片来源:Nat. Chem.


雷晓光课题组从2009年起就对中国传统中药——桑白皮中存在一类Diels-Alder类型加合物开展了全合成研究。这类天然产物具有共同的环己烯骨架结构,且具有多样的生物活性,包括抗氧化、抗菌、抗病毒,以及潜在的治疗糖尿病的功效(J. Asian Nat. Prod. Res., 2014, 16, 690–702.)。生源上,日本的Nomura教授课题组曾经通过喂养外源性底物证明了其是由查尔酮(亲二烯体)和不同二烯体之间通过分子间DA反应形成的(J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1990, 8, 610-613)(如图2a/b所示)。雷晓光课题组首次发展了手性硼酸催化的不对称DA反应方法学,并且实现了该家族多个天然产物分子的首次不对称全合成(Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 9257; Org. Lett.,  2016, 18, 360; J. Org. Chem., 2016, 81, 458)。

图3. 雷晓光课题组报道的不对称DA反应和天然产物全合成


在全合成的基础之上,雷晓光课题组提出了一种新颖的基于生物合成中间体探针分子(biosynthetic intermediate probe, BIP)的靶标垂钓化学生物学策略(BIP-based target identification),并结合传统活性导向蛋白分离以及转录组测序等方法(图2c),希望可以寻找到未知的分子间DA反应酶。


雷晓光课题组与戴均贵课题组、黄璐琦课题组合作首先以morachalcone A(2)和moracin C(3)为底物进行了活性导向蛋白分离。经过多步蛋白纯化,成功富集出BBE-like protein家族蛋白(图4-b-v),结合该粗酶液氧化生成4需要氧气的参与以及产生过氧化氢的现象,证实了BBE-like protein家族蛋白参与了3的氧化的过程。为了探究Diels-Alderase,作者设计和合成了基于亲二烯体morachalcone A(2)的生物合成中间体探针分子8,如图4c所示。利用该探针分子,作者发现BBE-like protein与该探针分子也有相互作用,这暗示着桑树中的BBE-like protein很可能也是Diels-Alderase。

图4. 活性导向的蛋白分离以及探针分子。图片来源:Nat. Chem.


随后作者利用转录组测序在桑树愈伤组织中共鉴定了14个BBE-like protein家族蛋白,其中MaMO和MaDA表达量最高。MaMO能够氧化moracin C(3)生成二烯体(4),而MaDA却不能。MaDA能够催化催化二烯体(4)和morachalcone A(2)发生分子间[4+2]环化反应,而MaMO在同样条件下却不能催化该反应的发生,如图5所示。这说明MaDA是首个催化分子间[4+2]环化反应的单功能酶。

图5. MaMO和MaDA的活性检测和酶学常数测定。(a), i)标准化合物3,ii)标准化合物4,iii)化合物3与MaMO,iv)化合物3与缓冲液; (b), i)标准化合物4,ii)标准化合物2,iii)标准化合物1,iv)化合物24与MaDA,v)化合物24与缓冲液; (c),MaMO底物(3)的动力学分析; (d),MaDA底物(2)的动力学分析。图片来源:Nat. Chem.


研究人员还探究了MaDA的底物适应性。不同的morachalcone A的衍生物(5-7)及其类似物(15,16)均能被MaDA识别,化合物61416的转化率显著降低,如图6a所示。利用MaDA催化的endo专一性的DA反应,作者实现了包括chalcomoracin在内的多个天然产物及其类似物的首次不对称全合成,如图6b所示。这些实验结果表明,作为一个催化分子间DA反应的酶,MaDA对二烯体和亲二烯体都具有很好的底物兼容性,可作为一种高效的生物催化剂,用于endo D-A类型化合物的不对称合成。同时,这些结果也揭示了桑树中endo D-A类型天然产物结构的多样性可能来自于MaDA底物的宽泛性。

图6. MaDA底物适用性的探究。图片来源:Nat. Chem.


为了探究该分子间[4+2]反应的机理,课题合作者美国UCLA大学化学系K. N. Houk教授和Shuming Chen博士首先对非酶促的分子间[4+2]反应进行了DFT机理计算。DFT计算表明,endo 产物过渡态比exo产物过渡态在能量上低2.8–3.0 kcal mol-1,如图7a所示。在endo 产物过渡态中,将要形成的两根C-C键分别为2.03和 2.69 Å(图7a),这说明该环化反应可能是通过协同但不同步的反应机理进行的(concerted but asynchronous reaction)。作者还测定了酶促反应中二烯体10上不同位置的KIE数值,其实验结果也支持MaDA催化的[4+2]环化反应是一个协同但不同步的DA反应(图7b)。这些数据支持MaDA是一个真正意义上的分子间DA反应酶。

图7. (a) DFT计算;(b) KIE测定。图片来源:Nat. Chem.


为了进一步探索MaDA的催化机制,雷晓光课题组成功解析了MaDA的晶体结构(2.3 Å),如图8a所示。通过将产物chalcomoracin(1)对接进MaDA的口袋中发现,F356、N357、L358、L373、N374和F375可能与二烯体(4)有相互作用,而V177、I259、F292、Y192 和 R443可能与亲二烯体morachalcone A(2)有相互作用,如图8b所示。基于此,作者将可能与产物形成相互作用的氨基酸进行了突变,结果显示,F375、R443、F356、I259以及Y192对于维持MaDA的活性至关重要;同时,作者还发现氧化态的FAD对于MaDA的活性也非常重要,如图8c所示。

图8. 基于MaDA晶体结构的分子对接以及点突变实验揭示了MaDA与底物形成相互作用的关键位点。图片来源:Nat. Chem.


总结


综上所述,研究者通过活性导向蛋白分离、基于生物合成中间体探针(BIP)的靶点垂钓和转录组分析相结合的策略成功在桑树愈伤组织中鉴定了两个FAD依赖的蛋白——MaMO和MaDA。其中,MaDA为首例催化分子间[4+2]环化反应的单功能酶。作者通过DFT以及KIE实验证明了该酶促反应为协同但不同步的DA反应,因此,MaDA是首个从自然界中发现的催化分子间DA反应的单功能DA反应酶,从而结束了学术界一直存在的“自然界是否有真正意义DA反应酶”的争论。作者还成功解析了MaDA的晶体结构,并初步阐明了底物和蛋白相互作用的机制。此外,MaDA有很好的底物宽泛性,利用MaDA实现了多种D-A类型天然产物的酶法合成该酶法合成展现出普通化学方法难以实现的高效性与立体化学专一性,体现了MaDA在生物催化中的优势和特点,为发展酶催化合成方法来高效制备结构多样的功能有机分子开辟了新的研究方向。此外,本研究所提出的基于天然产物生物合成中间体小分子探针(BIP)靶点发现的化学生物学研究手段也会为阐明天然产物生物合成途径、发现新颖的生物合成酶提供新的研究方法与思路。


在本工作中,雷晓光课题组高磊博士、戴均贵课题组苏聪博士、雷晓光课题组杜晓霞博士以及黄璐琦课题组王瑞杉博士为共同第一作者。北京大学雷晓光教授、中国医学科学院药物研究所戴均贵研究员以及中国中医研究院黄璐琦研究员为共同通讯作者。北京生命科学研究所的周宇博士和黄牛研究员以及UCLA的Chen Shuming博士和K. N. Houk教授在计算模拟、DFT计算方面做出了重要贡献。此外,北京生命科学研究所的陈涉研究员,中国中医科学院的郭兰萍研究员,北海道大学的Oikawa教授、Minami副教授和刘成伟助理教授,以及帝京平成大学的Hano教授和Shimazaki教授也在质谱分析、转录组分析以及酶活测试等方面提供了重要帮助。该工作得到国家自然科学基金,国家科技部重点研究发展计划,北京市“卓越青年科学家计划”,北京分子科学国家研究中心,北大-清华生命科学联合中心,天然药物活性物质与功能国家重点实验室等多个国家重大科研项目和研究机构的资助。


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):

FAD-dependent enzyme-catalysed intermolecular [4+2] cycloaddition in natural product biosynthesis

Lei Gao, Cong Su, Xiaoxia Du, Ruishan Wang, Shuming Chen, Yu Zhou, Chengwei Liu, Xiaojing Liu, Runze Tian, Liyun Zhang, Kebo Xie, She Chen, Qianqian Guo, Lanping Guo, Yoshio Hano, Manabu Shimazaki , Atsushi Minami, Hideaki Oikawa, Niu Huang, K. N. Houk, Luqi Huang,* Jungui Dai,* Xiaoguang Lei*

Nat. Chem., 2020, DOI: 10.1038/s41557-020-0467-7


导师介绍

戴均贵

https://www.x-mol.com/university/faculty/27240

雷晓光

https://www.x-mol.com/groups/lei_xiaoguang


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