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基于单分子荧光探针用于神经元线粒体内H2O2和ATP的同时定量检测与实时荧光寿命成像

线粒体氧化还原稳态与能量代谢对于生物体而言是至关重要的,这是因为线粒体是各类活性氧物种(reactive oxygen species,ROS)与直接能量来源ATP产生的最主要场所,ROS控制着氧化还原稳态而ATP则主导着能量代谢,这两大生理活动是线粒体的中心事件。事实上,在一些神经退行性疾病如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)中,细胞均表现出异常的氧化应激和能量代谢受损。因此,对这些事件相关分子的研究不仅为疾病的病理机制提供了相关解析,而且也为靶向性和治疗性药物的开发提供新策略。H2O2,作为相对来说较为稳定的ROS,是维持线粒体氧化还原过程的主要分子之一,也是线粒体氧化损伤的重要信使。另一方面,ATP则是调节线粒体能量代谢的重要信使。值得一提的是,H2O2与ATP有着密切的相互联系。在线粒体呼吸链中,生成ATP的同时并伴随着超氧阴离子(O2•-)的产生,而O2•-会迅速地与SOD发生歧化反应转换为H2O2,更高的代谢速率会导致更多H2O2的产生。此外,ATP的合成受损也反过来导致线粒体膜电位的变化进而引起H2O2的增加。与此同时,过量的H2O2会进一步损伤线粒体内的相关酶,蛋白质和DNA等,影响线粒体的正常生理功能,同样使得ATP的合成难以进行。因此,同时监测线粒体内H2O2和ATP含量的实时动态变化具有重要意义。

图1. TFP探针工作原理示意图。


近日,华东师范大学田阳教授(点击查看介绍)课题组成功设计并合成了一种基于双光子荧光寿命探针(TFP),该单个探针可同时用于H2O2与ATP的高准确度、高选择性的检测(图1)。TFP探针主要由三部分组成:线粒体靶向部分、H2O2响应部分和ATP响应部分。由于线粒体膜电位为高度负电性,探针的吡啶阳离子有助于其在线粒体内聚集,具有靶向线粒体的作用。H2O2响应部位是萘酰亚胺荧光团衍生物,该部位的苯硼酸酯可以抑制荧光团的荧光。由于H2O2可以选择性地与苯硼酸酯发生反应将其脱去,这就使得萘酰亚胺荧光团的荧光恢复。ATP响应部位是二乙烯三胺修饰的罗丹明螺环衍生物,该衍生物具有多个氨基,很容易捕获ATP。这主要是由于ATP的多个磷酸基团可以和氨基形成氢键,迫使螺环内酰胺被打开,同时ATP的嘌呤结构可以与罗丹明荧光团部位形成π-π堆积作用,最终产生荧光。由于TFP探针的萘酰亚胺与罗丹明荧光团具有很好的光谱分离效果,因此并未发生荧光共振能量转移,在710 nm的双光子激发波长下,探针不同成像通道的荧光强度与平均荧光寿命对0.4-10 μM H2O2和0.5-15 mM ATP均呈现了良好的线性关系,可完成两种分子的同时定量检测。随后,研究人员将该探针运用到神经元细胞内荧光寿命成像,研究了不同状态下线粒体内H2O2和ATP的含量变化,并实时观察了它们在O2•-诱导刺激下的动态变化。研究发现,在短时间内(8分钟)的O2•-刺激下,线粒体内H2O2和ATP的含量会暂时有所改变,而神经元完全有能力在短时间内恢复到初始状态。然而,当O2•-刺激时间增加到50分钟时则会导致神经元永久性氧化损伤和能量匮乏(图2)。同时,研究还发现外源性O2•-和H2O2刺激对线粒体功能有不同的影响,相同条件下,O2•-对神经元造成的损伤远比H2O2严重。此外,由于TFP探针的双光子吸收性能,其可用于分析正常氧和缺氧条件下幼体斑马鱼体内H2O2和ATP的水平。事实上,这项工作不仅为多物质同时成像提供了一种通用的分子设计方法,而且还揭示了氧化应激状态下线粒体内H2O2和ATP相关变化。

图2. O2•-诱导刺激下神经元线粒体内H2O2和ATP实时荧光寿命成像。


相关研究成果发表在Journal of the American Chemical Society上,同时也被JACS的Spotlights专题介绍,文章的第一作者是华东师范大学的硕士研究生吴洲,通讯作者为田阳教授。


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):

Real-Time Imaging and Simultaneous Quantification of Mitochondrial H2O2 and ATP in Neurons with a Single Two-Photon Fluorescence-Lifetime-Based Probe

Zhou Wu, Mengmeng Liu, Zhichao Liu, Yang Tian

J. Am. Chem. Soc., 2020, 142, 7532−7541, DOI: 10.1021/jacs.0c00771


导师介绍

田阳

https://www.x-mol.com/university/faculty/49547

课题组主页

http://yangtian.chem.ecnu.edu.cn/index.aspx


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