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异构赋能:诊疗试剂设计的新思路

传统上,疾病的检测与治疗互相独立。究其本源,前者需要物理信号的反馈,而后者则利用生物化学反应。近年来,诊疗一体化(theragnostics)逐渐兴起,向我们展示了如何将医学诊断和治疗合二为一,以“相辅相成”的方式提高疾病防控的可能性。然而,不同功能的分子往往化学结构相差很大。为达成这一目的,常常需要将不同功能的分子连接起来,这些分子的设计和合成无疑会耗费大量的时间与精力。同时,由于这些组分化学本质的不同,其应用条件(如剂量)的兼容性难以得到保证。因此,能否通过简单的化学手段,合成结构相似但功能不同的分子,实现“一体化”与“多功能”的兼容,成为解决医学诊疗试剂设计的新思路。


北京大学张俊龙课题组的研究方向为生物无机化学,在金属酶模拟、稀土化学生物学和金属药物化学三方面开展研究。该课题组以卟吩内酯为模型,建立模拟天然金属四吡咯辅酶的分子库,考察“共轭度”和“区域异构效应”的结构微调方式,精准调控分子(金属)电子结构和激发态(Acc. Chem. Res., 2019, 52, 2620-2633)。该课题组首次将卟吩二内酯作为考察四吡咯区域异构效应的分子模型,发现内酯基团的相对取向,对光吸收等性质的调控(J. Am. Chem. Soc., 2014, 136, 9598– 9607)。区域异构效应对激发态的调控增进了人们关于金属四吡咯的了解(J. Am. Chem. Soc., 2015, 137, 10745– 10752),推动该概念在发光及相关材料、催化以及分子自组装等的应用(Inorg. Chem., 2017, 56, 1897– 1905;Chem. - Eur. J.,  2016, 22, 9676– 9686;Nano Lett., 2019, 19, 3267-3272)。结合理论研究表明,四吡咯分子芳香性与区域异构效应呈现负相关( Phys. Chem. Chem. Phys., 2019, 21, 10152),这为推动区域异构在赋能分子设计方面提供新思路。基于此,张俊龙课题组与美国德州大学奥斯汀分校Jonathan Sessler课题组合作,设计了新的合成路线,利用同一个化学反应,得到了两种新型顺式、反式卟吩二内酯异构体,通过近红外光学成像以及光动力治疗实验,验证了两个异构体在检测与治疗中的功能裂分,提出“异构赋能”的诊疗试剂设计新思路。相关成果在线发表于J. Am. Chem. Soc.。


作者从β位全氟取代的卟啉出发,使用钌催化的Oxone®氧化法同时合成了顺式与反式的β-氟取代卟吩二内酯cis-1 与trans-1,并通过与肌氨酸、甲醛的[3+2]环加成反应合成了具有β位饱和碳碳键的卟吩二内酯衍生物cis-2 与trans-2,以及内酯羰基发生环加成反应的副产物cis-3与trans-3。其中所有的顺式、反式异构体均由同一反应生成,且可通过硅胶柱色谱分离。对于cis-2 与trans-2,其β位引入的饱和度阻断了卟吩二内酯类似菌绿素的18电子芳香体系,而使之变为16电子共轭。这一改变显著地放大了顺式、反式内酯基团对卟啉电子结构的影响,并显著地体现在紫外-可见吸收光谱(实线)与荧光光谱(虚线)中:trans-2的Q吸收峰相对cis-2发生了83 nm的红移。这一数值在cis-1 与trans-1中仅为21 nm。副产物cis-3与trans-3则仍然保留了原有的18电子共轭体系,其吸收光谱类似cis/trans-1以及一般的菌绿素,顺式、反式异构体Q峰的波长移动也仅为29 nm。

图1. 相关分子的合成路线(左)与吸收、荧光光谱(右)


由于cis-2 与trans-2间存在显著的光谱差异,作者猜测两种配体在结合稀土离子后,其敏化稀土传能的效率可能有较大的差别,而这一效应在cis/trans-1或cis/trans-3中则很可能不明显。因此将cis/trans-2与镱(Yb)盐以及Klaui配体进行反应,得到了配合物Yb-cis/trans-2。Yb-cis-2的晶体结构显示,β位引入的吡咯环相对于轴向的Klaui配体具有向上(up)、向下(down)的两种构型。这一现象也出现在了相应的Yb-trans配合物中。无论cistrans,向上、向下的两种构型均可以通过硅胶柱完全分离并分别结晶,但镱的近红外发光量子产率在有机溶剂中没有明显差别,因此作者没有对上、下构型的影响进行进一步探讨。

图2. 向上、向下构型Yb-cis-2的晶体结构


为验证上述猜想,作者分别测定了Yb-cis-2与Yb-trans-2的近红外发射光谱与相应的量子产率。结果表明,在二氯甲烷溶剂中,Yb-cis-2的近红外发射量子产率约为13% ,而Yb-trans-2的量子产率则接近0。红外摄像机的图像更明显地体现出这一不同:在相同的样品浓度与激发光强度下,Yb-cis-2的二氯甲烷溶液具有明显的近红外发射,而Yb-trans-2样品则近乎完全黑暗。作为对照,Yb-cis/trans-1的近红外发射量子产率差别仅为7倍。通过进一步对比,作者发现在通过环加成反应引入β位饱和度后,Yb-cis配合物的近红外发射得到了显著增强,而Yb-trans配合物的近红外发射则有所下降。

图3. Yb-cis/trans-1以及Yb-cis/trans-2的光物理数据


上述光谱印证了作者通过化学修饰调节卟啉电子结构,可以有效调节对稀土的敏化传能。为了理解这一机制,作者分别测定了Lu-cis/trans-1/2在77 K下的发射光谱。镥(Lu, +3)离子全满的电子壳层使其不具有荧光发光性质,而其重原子效应可稳定配体的三线态,因此可以通过镥配合物的磷光波长推断配体的三线态能级,进而分析结构相似的Yb配合物中配体-稀土的传能效率。上图(d)部分的结果表明,cis-2的三线态能级显著地高于镱的2F7/2激发态,从而使cis-2能有效地作为天线分子将能量传递至镱离子,Yb-cis-2具有较强的近红外发射;trans-2的三线态能级则显著地低于镱的2F7/2激发态,这使得trans-2无法向镱离子传能,Yb-trans-2几乎不具有镱的近红外发射。作为对照,cis-1的三线态能级低于cis-2而更接近镱的2F7/2激发态,这导致Yb-cis-1中由镱向配体的能量回传得到增强(在变温发射光谱中得到证明),而镱的近红外发射相对于Yb-cis-2明显减弱;trans-1的三线态能级则略高于trans-2,这使得Yb-trans-2的镱近红外发射相比Yb-trans-1进一步减弱。


由于trans系列配合物无法实现由配体向镱离子的传能,其三线态在室温下可能被氧气猝灭产生单线态氧(1O2)。作者推断trans系列配合物可能具有较高的单线态氧量子产率,因此分别通过DPBF-紫外可见吸收以及单线态氧近红外发射两种方法测定了上述配合物的单线态氧量子产率。结果表明,Yb-trans-1与Yb-trans-2的单线态氧量子产率约为56%。因配体部分向镱传能,Yb-cis-1的单线态氧量子产率略低,约为44%。而由于配体向镱的传能效率较高,Yb-cis-2的单线态氧量子产率小于10%,为该系列配合物中最低。


总结光物理数据,作者发现Yb-cis-2具有较高的镱近红外发射量子产率,因此有潜在的成像应用价值;Yb-trans-2则表现出较高的单线态氧量子产率,可以应用于光动力治疗。为实现相应的生物应用,作者对引入的吡咯环氮原子甲基化,得到了带有正电荷、具有较高水溶性的Yb-cis/trans-2+。经水溶性修饰的Yb-cis-2+在水相中的仍具有相当高的近红外量子产率(约6.3%),而Yb-trans-2+则没有近红外发射。细胞成像结果显示,Yb-cis-2+在细胞中依然表现出近红外发射(图4 (b),红),而且Yb-trans-2+没有表现任何近红外发射。LysoTracker(图4 (b),绿)共定位实验表明Yb-cis-2+主要分布于细胞的溶酶体中。针对Yb-trans-2+较高的单线态氧量子产率,2,7-二氯二氢荧光素(活性氧物种探针,(c)部分)实验表明,在光激发下Yb-trans-2+产生了远多于Yb-cis-2+的细胞内活性氧物种(图4(c),绿)。这一结果在细胞光毒性实验中得以进一步验证。Yb-trans-2+孵育的细胞在光照下的半数致死浓度(IC50)为5.5 μM,而同样条件下Yb-cis-2+孵育的细胞存活率大于90%。

图4. (a) Yb-cis/trans-2+的水溶性修饰;(b) Yb-cis/trans-2+的细胞近红外成像实验;(c) Yb-cis/trans-2+的细胞内活性氧物种检测实验;(d) Yb-cis/trans-2+ (A), Yb-cis-2+ (B)以及Yb-trans-2+ (C)的小鼠体内近红外成像实验;(e) Yb-cis/trans-2+的小鼠体内光动力治疗实验。


基于细胞实验结果与光物理测定的高度一致性,以及近红外成像较高的组织穿透性,作者分别使用介孔二氧化硅纳米颗粒作为载体包裹了Yb-cis/trans-2+,并将相应复合物应用于带有4T1肿瘤的BALB/c小鼠。在尾部静脉注射48小时后,作者在Yb-cis/trans-2+混合(图4(d)-A)以及Yb-cis-2+(图4(d)-B)的近红外图像中观察到相当强的近红外发射,且其主要聚集于肝、脾脏,以及肿瘤组织中。与之对应的Yb-trans-2+(图4(d)-C)则并未表现出明显的近红外发射。体内的光动力治疗实验结果表明(图4(e)),Yb-trans-2+ 或Yb-cis/trans-2+混合应用的小鼠在培育25天后,其体内的肿瘤相较空白对照组(PBS)有显著的缩小。Yb-cis-2+组的肿瘤体积相对于空白对照组略有缩小,但其幅度并没有超过空白对照组的误差范围。由此,可以得出结论,Yb-cis-2+在体内表现出较强的近红外发射,Yb-trans-2+在体内对肿瘤组织具有较高的光毒性;二者按产率比例混合(等同于不进行异构体分离操作)的产物则可被视为潜在的检测-治疗一体试剂。


总结全文,作者通过简单的卟啉β位[3+2]环加成反应,通过同一系列反应合成了结构相似的异构体Yb-cis/trans-2。这一化学修饰有效调控了Yb-cis/trans-2的电子结构与光物理性质,使得卟啉β位内酯羰基的朝向成为了调节近红外发光与单线态氧生成两种不同功能的开关。在概念验证性的细胞与小鼠实验中,作者分别展示了Yb-cis-2+的近红外成像与Yb-trans-2+潜在的光动力治疗应用,以及二者不需分离的混合物直接作为检测-治疗一体试剂进行应用的可能。


本文工作发表于J. Am. Chem. Soc.。2014级博士生宁莹莹与2014级本科生刘一苇为本工作的共同第一作者。该研究工作得到北京国家分子科学研究中心、国家自然科学基金等的经费资助。


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):

Split and Use: Structural Isomers for Diagnosis and Therapy

YingYing Ning, Yi-Wei Liu, Zi-Shu Yang, Yuhang Yao, Lei Kang, Jonathan L. Sessler, Jun-Long Zhang

J. Am. Chem. Soc., 2020, 142, 6761-6768, DOI: 10.1021/jacs.0c01155


张俊龙教授简介


张俊龙,北京大学化学与分子工程学院特聘研究员。2005年博士毕业于香港大学化学系,导师为支志明院士。2005-2008在美国伊利诺伊大学-香槟分校(导师:陆艺教授)从事博士后工作。2008进入北京大学化学与分子工程学院开始独立的研究工作。研究方向包括:1)金属酶结构和功能模拟;2)稀土化学生物学;3)金属药物化学。已在J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Chem. Sci.等杂志发表八十余篇论文。2016年被美国化学会评为“Emerging Investigators in Bioinorganic Chemistry”;2017年获中国稀土学会青年科学家奖;2018 获得日本化学会“The Distinguished Lectureship Award”和欧洲化学出版协会“ChemPubSoc Europe Early Career Award”。


课题组网站:https://www.x-mol.com/groups/Zhang_Jun-long


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