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化学家探案——天然产物结构“洗冤录”

天然来源化合物的结构鉴定历来是有机化学研究中最有趣也最富争议的领域之一。虽然X射线单晶衍射技术能很好确定未知化合物结构,可是晶体生长受到的影响因素很多,许多天然产物很难大量提取或合成,能够用于结构分析的晶体可遇而不可求,只能依靠“四大名谱”——核磁一维二维图谱、高分辨质谱、红外和紫外图谱来确定结构。一般来说四大名谱的测定数据是“靠谱”的,但是人工解读有时候会出现偏差。例如,有些核磁图谱中会出现谱峰重叠现象,这时候我们归属信号可能会发生错误,属于“张三”的信号判定给了“李四”,这样就造成了整个结构解析的错误。还有一些核磁图谱中,关键部位的连接由于缺少氢碳原子没有出信号,只能结合质谱以及其它图谱来猜测,这样就会出现多种可能结构,甚至可能出现误判。


对于从事天然产物研究的小伙伴来说,遇到这些情况是非常闹心的。笔者在本文中想介绍的两项工作,分别来自美国加州大学戴维斯分校Dean J. Tantillo团队和韩国首尔大学Dong-Chan Oh团队,他们使用精巧的方法找寻蛛丝马迹,终于让被误判的天然产物结构“沉冤得雪”。

Dean J. Tantillo教授(左),Dong-Chan Oh教授(右)。图片来自各自学校官网


核磁连接信号有盲区的serlyticin-A


第一个故事来自化合物serlyticin-A。它分离自以鱿鱼骨作为唯一碳氮源的解脲沙雷菌(Serratia ureilytica)培养基中,具有抗氧化和抗细胞增殖活性。其最初推测的结构(1)是两个吲哚乙酸依靠过氧键连接在一起,其过氧连接部分没有核磁信号,是核磁谱图中的“盲区”,这使得结构颇有争议。Dean J. Tantillo等认为这个结构是错误的,并列举了三个理由:(一)这个过氧键在溶液中不稳定,计算化学结果显示该键容易断裂;(二)核磁数据只能证明吲哚部分的存在,纵观四谱都找不到N-O-O-N存在的确凿证据;(三)高分辨质谱数据也不匹配(此推测结构的高分辨质谱 为380.1008,实验测定值为381.2629)。

最初推测的serlyticin-A结构。图片来源:J. Nat. Prod. [1]


为了解决争议,他们使用量化计算的策略。在气相和溶液中对1进行结构优化,得到的O-O键较长(2.10 Å)。在包括最低构象在内的所有构象中,计算Wiberg键级小于0.32,这说明1在气相和溶液中均易断裂。优化这些构象以缩短O-O键(1.48 Å)又会导致自由能偏高。且计算的13C和1H核磁化学位移与报道的实验数据偏差太大。多个计算化学的结果提示serlyticin-A极有可能被错误解析。

计算13C和1H化学位移与1(左图),O-O键约束下的1(右图)实验值偏差。图片来源:J. Nat. Prod. [1]


已报道的核磁数据显示serlyticin-A含吲哚-3-乙酸。基于此,他们提出一系列含此部分的备选结构,通过计算核磁数据和实验核磁化学位移比对,筛选出含肼(2)、羟胺(3)、羟肟酸(4)三个备选结构,其中又以4的化学位移匹配度最高。这三个结构都和serlyticin-A一样具有抗氧化活性。经过细致分析,他们认为4最有可能是serlyticin-A,并列举几点理由:(一)N-氨基类吲哚天然产物(2)以前没有被报道过;(二)N-羟基类吲哚天然产物(3)虽然有报道,但这类产物很少见,往往难以分离,且绝大多数已知N-羟基吲哚天然产物在吲哚的2位具有取代;(三)4含有的羟肟酸基团,存在于许多细菌来源的天然产物种,羟肟酸是极好的铁载体,细菌经常产生它们以从环境中获取铁。此外,许多含羟肟酸化合物具有抗细胞增殖活性,这在serlyticin-A中也有发现。

结构2、3、4的计算13C和1H化学位移与实验值的偏差。图片来源:J. Nat. Prod.[1]


接下来,他们直接合成了化合物4,并对其进行表征,所得数据与以前的研究结果一致,其1H和13C核磁化学位移与计算值也吻合。从高分辨质谱数据来看,41的测试质量(加氢阳离子模式)分别为381.2629和381.1563,而serlyticin-A的计算质量为380.1008,显然4更合理。因此,Dean J. Tantillo等认为serlyticin-A是一类非共价型天然产物二聚体。


核磁信号有重叠的tripartilactam


另一个有趣的化合物是tripartilactam (1),它分离自一种生活于屎壳郎粪球的链霉菌Streptomyces sp. SNA112。最初报道它是一个含有独特[18,8,4]-三环框架的大环内酰胺。这个结构存在争议,另一个课题组从链霉菌和细菌的混合培养中分离到一个含[18,6,6]-三环体系的大环内酰胺 niizalactam C (2),并认为 niizalactam C (2) 就是 tripartilactam (1)。虽然两者的一维和二维核磁数据很相似,但是tripartilactam (1) 和niizalactam C (2) 核磁测试用的溶剂分别是氘代二甲亚砜(DMSO-d6)和氘代氯仿(CDCl3),使得结构争议一时难以下定论。

Tripartilactam (1) 和niizalactam C (2)的化学结构。图片来源:J. Nat. Prod.[2]


这个结构悬案引起了韩国首尔大学Dong-Chan Oh教授等人的兴趣。他们首先仔细分析了tripartilactam的一维和二维核磁数据。发现结构1有几个可疑的地方:(一)H-13 (δH 5.71) 和 H-14 (δH 4.52)没有COSY相关,而基于密度泛函(DFT)计算两者的二面角是67.1°,应该存在COSY相关;(二)H-9 (δH 2.38) 和 H17 (δH 2.43)的信号存在重叠,导致了H-16 (δH 3.54)是与H-9,还是H17,亦或与二者都连接存在争议,这又对结构中环丁烷部分是否存在至关重要;(三)在HMBC数据中,未观察到从H-14 (δH 5.71) 到 C-13 (δC 74.3) 或者从 H-13 (δH 4.52) 到 C-14 (δC 130.4)的相关性。却存在H-17(δH 2.43)与C-10(δC 210.0)的“四键”信号相关。


为了确定tripartilactam的结构,Dong-Chan Oh等选择了13C−13C COSY 核磁实验,因其能直接展示化合物碳骨架的相互关联。由于自然界中13C同位素丰度低,他们用含13C同位素的葡萄糖培养基发酵链霉菌SNA112菌株,以获得富集13C的tripartilactam。在13C−13C COSY 核磁图谱中,C-9 (δC 48.6)与C-11 (δC 70.3) 有一键相关,C-16 (δC 44.4)与C-10酮羰基碳耦合,其余部分连接方式都与原结构吻合。这充分证明最初报道的tripartilactam (1) 结构是错误的,且基于化合物整个13C−13C COSY连接关系可以毫无争议地确定tripartilactam就是niizalactam C (2)。

Tripartilactam (1)和niizalactam C (2) 结构中观察到的13C−13C COSY一键相关。图片来源:J. Nat. Prod.[1]


为了从生源合成关系的角度验证tripartilactam的结构。他们对链霉菌SNA112进行全基因组测序,并运用生物信息学和基因突变技术进行分析,推测1型聚酮合酶模块(PKSI)基因中存在合成此化合物的基因簇。由于这个假定的基因簇与最近报道的sceliphrolactam基因簇高度同源,他们推测sceliphrolactam可能是tripartilactam的前体,通过自发非酶促反应转化为后者。为此,他们设计实验将sceliphrolactam溶于二甲亚砜(DMSO),室温下放置5天,用液相质谱(LC/MS)联用技术进行检测,3天后即检测到tripartilactam。这表明sceliphrolactam可以通过自发的[4+2]环加成形成tripartilactam。

推测的tripartilactam生物合成途径。图片来源:J. Nat. Prod. [2]


最终,他们通过13C−13C COSY 核磁图谱并结合生物信息学分析和基因突变实验,成功解决这一结构争议,确定了tripartilactam的结构其实是niizalactam C (2)。


小结


两个棘手的结构悬案,一个核磁连接信号有盲区,一个核磁信号有重叠,最后分别用量化核磁化学位移计算分析和13C−13C COSY 核磁图谱成功破解。这让笔者不禁感慨,要想成为一位优秀的天然产物专家,有时候得像“探案”的福尔摩斯一样足智多谋且明察秋毫。


参考文献:

1. Reconsidering the Structure of Serlyticin‑A. J. Nat. Prod., 2019, 82, 3464-3468, DOI: 10.1021/acs.jnatprod.9b00859

https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jnatprod.9b00859

2. Structure Revision and the Biosynthetic Pathway of Tripartilactam. J. Nat. Prod., 2020, 83, 578-583, DOI: 10.1021/acs.jnatprod.9b00819

https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jnatprod.9b00819


(本文由水村山郭供稿)


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