新型MAO-A特异性双光子荧光探针及其在人源胶质瘤组织中检测MAO-A活性的应用

注：文末有研究团队简介及本文科研思路分析

中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）是人体神经系统的最主体部分，其接受全身各处的传入信息，经它整合加工后成为协调的运动性传出，或者储存在其内部成为学习、记忆的神经基础。人类的思维活动是CNS的功能。CNS的病变往往会在较长一段时间内严重影响患者及其家庭的正常工作和生活，给社会带来沉重负担。CNS疾病中胶质瘤和帕金森病是两类致病机理完全不同的疾病，但是同属重大疾病的范畴。《“健康中国2030”规划纲要》中明确指出，要把人民健康发展放在优先发展的战略地位，同时需要把健康融入所有政策。其中，对于重大疾病的预防、诊断和治疗更是重中之重。在这样的背景下，科研工作者们专注CNS疾病预/诊/疗的研究，将目光聚焦在了其生化标志物的检测和功能调控上。单胺氧化酶（Monoamine Oxidases, MAOs）是表达于线粒体外膜上的一类功能型蛋白酶，氧化代谢生物体内单胺类物质，主要包括神经递质和外源性的氨类物质，其功能异常与CNS疾病关系密切。基于各自代谢底物的不同，MAOs分为两种亚型（MAO-A 和MAO-B），两者的氨基酸序列相似率高达70%以上。使用荧光探针来区分两者是一项具有挑战以及生物学意义的工作，由于MAOs的重要功能，科研人员已经开发多个MAOs的荧光探针，其中双光子荧光探针因更深的组织穿透性具有非常大的科学意义和实际应用价值。

近日，南京工业大学黄维院士、李林教授团队与新加坡国立大学Yao Shao Q.教授合作，基于“空间构型转换”的概念设计合成了一种新的MAO-A特异性双光子荧光探针，报道了其在人源胶质瘤组织中MAO-A活性检测的应用。

作者基于前期对MAO-B特异性探针的研究（Nat. Commun., 2014, 5, 3276），发现探针U1在与MAO-A和MAO-B进行docking时得到完全不同的结合模式，U1只有在与MAO-B结合时warhead朝向MAOs的活性位点，辅酶FAD，而与MAO-A结合时相反。因此，作者希望在U1的结构基础上设计一个新的MAO-A特异性双光子荧光探针。新的探针F1选择已知的MAOs底物MPTP的分子结构中的四氢吡啶作为检测基团，通过“瞬时共轭结构构建”的机理产生荧光信号的变化，旨在通过荧光信号增强的方式检测MAO-A的活性。根据docking的结果，F1只有与MAO-A结合时，四氢吡啶上的氮原子才会指向辅酶FAD，从而完成酶催化氧化，得到具有荧光的产物FD1，产生荧光信号。

作者首先在多种哺乳动物细胞系，以及通过CRISPR/Cas9调节MAOs表达的细胞模型上成功验证了F1对于MAO-A的选择性。基于以上结果，作者进一步对F1在组织上的应用进行了探索，分别对小鼠新鲜大脑组织，SH-SY5Y肿瘤组织，人胶质瘤组织（癌旁组织切片为参比）进行了成像，成像深度可以达到220 μm。并且他们发现加入MAO-A特异性抑制剂（Clorgyline，CL）可以很大程度抑制荧光信号的增强，且癌旁组织中MAO-A的活性远低于其它组织样品，这也与此前报道的癌旁组织中MAO-A表达量低的结果是一致的。该项工作为MAOs的检测及研究提供新的思路和新的工具。

这一成果近期以热点文章（Hot Paper）的形式发表在Angewandte Chemie International Edition 上，文章的第一作者是南京工业大学先进材料研究院的博士研究生方海啸同学。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Rational Design of Two-photon Fluorogenic Probe for Visualizing Monoamine Oxidase A Activity in Human Glioma Tissues

Fang Haixiao, Zhang Hang, Li Lin*, Ni Yun, Shi Riri, Li Zheng, Yang Xuekang, Ma Bo, Zhang Chengwu, Wu Qiong, Yu Changmin, Yang Naidi, Yao Shao Qin*, Huang Wei*

Angew. Chem. Int. Ed., 2020, DOI: 10.1002/anie.202000059

李林教授简介

李林教授课题组聚焦“线粒体光学检测与调控”的生物医学光子学研究，研究内容涵盖光子学/有机化学/生物医学工程，专注线粒体特异性的病理学生物体系显影新方法在早期诊疗和转化新药开发中的应用。研究成果在活体层面上分别揭示了小分子荧光探针在检测和调控蛋白质活性中的作用，同时在基因水平上阐述了该类光功能小分子生物功能调节剂在疾病诊断、信号转导和药物开发等生物医学领域巨大的应用前景。迄今为止，在Nature Communications, Accounts of Chemical Research, Journal of the American Chemical Society, Angewandte Chemie International Edition, Advanced materials等期刊上以第一/通讯作者身份累计发表SCI收录论文80余篇，申请/授权专利39/5项，参与编撰专著《分子影像与精准诊断》一本；主持国家/省部级科研项目7项，参与企业委托项目一项。先后当选中国青年化学家-元素周期表Mc元素代言人，“中国生物医学工程学会生物医学光子学分会”青年委员，“中国环境诱变剂学会活性氧生物学效应专业委员会”青年委员，《材料导报》编委，《Chinese Chemical Letters》青年编委，《中国临床药理学与治疗学》青年编委，新加坡神经医学研究院（NNI）客座研究员。

https://www.x-mol.com/university/faculty/27721

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：如上所述，MAOs具有重要的生物功能，与人的精神疾病及神经退行性疾病有着密切的关联。我们课题组一直关注MAOs不同亚型的功能差异与中枢神经疾病之间的联系，先后发表了多篇针对性的论文（Nature Communication, 2014, 5, 3276; Angew. Chem. Int. Ed., 2015, 54, 10821; Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58, 7657; Chembiochem, 2019, 20, 1487）。2014年在第一次解决MAO-B特异性双光子荧光探针结构设计问题之后，一直致力于寻找解决MAO-A 特异性双光子荧光探针结构设计问题办法，旨在完美实现同源蛋白质亚型的分类检测的目的，先后尝试了多种设计思路，有多位研究生在这其中做出了贡献。时至2017年我们终于找到了办法，后来不断在各种生物体系中验证探针的特异性和灵敏性，最终才有今天这个篇文章（Angew. Chem. Int. Ed., 2020, DOI: 10.1002/anie.202000059），在MAOs的两种同源亚型的功能核定上形成了完美的闭环。至此，我们也在努力总结/修订 “空间构型转换的荧光探针设计概念”，希望能有规律性的东西可以为未来的小分子荧光酶触探针的设计提供参考。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：研究过程中的挑战主要有两个：一个是如何理性地对同源蛋白质进行区分，从而基于此设计对应的荧光探针。MAO-A与MAO-B的氨基酸序列相似度高达70%，又具有相同的氧化机制，如何使设计的分子探针具有特异性是挑战之一。我们结合之前工作的基础和经验，使用molecular docking作为工具，更改不同的分子结构来与不同的蛋白晶体进行对接结合，结果作为探针设计的参考。对于更确切的选择机制，我们还在努力的研究中，希望早日能有更加规律性的总结，为后来的荧光探针设计提供指导，能有更大的突破。另一个挑战是不同级别的生物体系的验证。我们是一个光子学和化学学科背景为主的交叉性学科属性的课题组，在生物机制和疾病模型上积累太少，走了很多弯路。无论是人工重组蛋白的使用，还是代表性永生型细胞系的建立（我们特意花时间找公司帮忙建立了CRISPR/Cas9编辑的细胞系），到小鼠的荷质瘤，再到人源的胶质瘤样本，太多前辈和同行的帮助，才能最终完成整个体系的验证工作，提供了一份所有合作者都满意的答卷。这个过程我们学习了很多，也积累了很多，现在我们正在新的标志物体系中努力，但是这一次，我们更有信心完成任务。同时，经过这几年的学习，课题组也得到了淬炼，现在很多同行给我们的标签是具有“光子学+化学+生物医学”的多交叉性学科属性课题组。

Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助？

A：目前我们的预期，这个版本的MAO-A探针将会在胶质瘤信号分子通路的研究中发挥重要的作用。而清晰理解理解MAO-A在胶质瘤发生发展中的作用最临床预防、诊断和治疗该疾病都有重要意义。更深的层面上，我们的研究为MAOs同源两种亚型都提供了小分子双光子荧光探针，这相对于原本只能利用抗体区分的方法更进了一步，将为胶质瘤和帕金森病这两种机制完全不同的CNS疾病的相关性研究提供非常有力的研究工具。健康疾病是人类的永恒话题，诊断试剂公司和药物开发企业正不断努力地研发新的制剂和工具，以帮助人类解决我们面临的问题，我们觉得，作为年轻科技工作者，贡献自己的力量和智慧是我们这一代人的责任和担当。我们一定不断努力，在小分子荧光酶触探针领域潜心研究，争取更大的突破。