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双功能过氧化氢酶催化氧化环化反应

氧化环化反应是天然产物生物合成和化学合成中构建分子骨架的重要手段。化学合成中环化成键一般涉及手性控制、效率低、环境污染等问题,而酶能在比较温和的条件下立体选择性的催化成键反应,因此高效催化成键成环反应的酶展示出巨大应用潜力,引起了化学家的广泛兴趣。这些酶包括天然产物生物合成过程中的高效特异性催化C-C键形成的各种环化酶。近日,中国科学院微生物研究所高书山研究组在烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中鉴定了一个全新类型的双功能过氧化氢酶EasC,该酶不仅可以分解过氧化氢形成水和氧气,更令人惊讶的是,该酶利用氧气作为氧化剂,通过氧化脱羧构建新的C-C键成环,达到合成麦角生物碱类药物的药效团ergoline中间C环的目的(图1)。

图1 麦角生物碱药效团ergoline中间C环生物合成


EasC来源于烟曲霉麦角生物碱的生物合成基因簇,它与过氧化氢酶中的小亚基家族(SSC)高度同源,含有与SSC类似的heme和NADPH结合位点。研究者在大肠杆菌中纯化得到了可溶性的EasC蛋白,并在体外证明了该酶可以高效催化过氧化氢分解生成氧气(图2a)。这些生物信息学证据与生化证据都证明了EasC是一个过氧化氢酶。但是研究者进一步的同源蛋白序列比对发现,相较于传统的过氧化氢酶,EasC又具有多个不同的保守氨基酸位点;进一步的进化树分析发现,EasC蛋白处于一个全新的、未表征的独立分支(图2b)。这些生物信息分析结果都指向该酶与普通的过氧化氢酶具有不同的功能。由于麦角生物碱生物合成基因簇中其他酶都已经被证实没有参与C环的生物合成,因此研究者推理EasC除了具有过氧化氢酶活性之外,还能通过催化形成新的C-C键来合成C环。体外生化实验证实了研究者的推论,该酶在空气中能将化合物1高效转变为化合物2,高效特异性催化手性C5-C10单键的形成(图3)。然后研究者利用各种生化反应手段,包括反应体系添加或不添加过氧化氢、无氧催化、有氧催化、同位素标记(18O2和H218O)等,在体外发现EasC蛋白是利用氧气作为氧化剂,而不是过氧化氢,生成酶活性中间体Compound I;Compound I引发了接下来的一系列反应,包括氧化脱酸、C5-C10关环以及最后的羟基化反应(图3)。加州大学洛杉矶分校的Prof. K. N. Houk课题组利用密度泛函理论计算证明了该反应机制的合理性,例如关键的C5-C10键形成(图3: 化合物4→6)是一个低能过渡态反应(ΔG = 6.1 kcal/mol)。这是首例过氧化酶参与的、利用氧气作为氧化剂,催化新的C-C成键与氧化成环反应。

图2 EasC过氧化氢酶活性和蛋白聚类分析


图3 推测EasC的催化机理


本篇文章报道的过氧化氢酶代表了一种全新类型的生物催化剂,证明了自然界可以将普通的过氧化氢酶进化成可以催化复杂C-C成键与氧化环化反应的单加氧酶。本项目解决了该类药物研究中半个多世纪以来悬而未决的难题,丰富了催化C-C成键与氧化环化反应的生物催化剂类型,证明了过氧化氢酶具有广泛生物催化开发前景。


该研究成果近期发表在J. Am. Chem. Soc.,助理研究员姚永鹏博士和博士后安春艳博士为论文共同第一作者。该工作受到科技部重点研发计划、中科院先导专项、自然科学基金委面上和青年项目以及中国科学院青年促进会会员项目的经费支持。


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):

Catalase Involved in Oxidative Cyclization of the Tetracyclic Ergoline of Fungal Ergot Alkaloids

Yongpeng Yao, Chunyan An, Declan Evans, Weiwei Liu, Wei Wang, Guangzheng Wei, Ning Ding, K. N. Houk*, Shu-Shan Gao*

J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 17517-17521, DOI: 10.1021/jacs.9b10217


高书山博士简介


高书山,中国科学院微生物研究所研究员,博士毕业于中国科学院海洋研究所,毕业后先后在英国布里斯托大学化学系从事研究助理,在加州大学洛杉矶分校化学与生物分子工程系Yi Tang组从事博士后研究。曾获中国科学院院长优秀奖(2011年)。2018年全职引进至中国科学院微生物研究所。高书山课题组主要研究领域为真菌天然产物生物合成、临床化学药物分子的酶工程化、生物合成酶的合成生物学研究,在Journal of the American Chemical Society, Angewandte Chemie International Edition(封面文章2017), Natural Product Reports, Organic Letters, Journal of Natural Products等著名期刊上发表近30篇SCI文章,多篇研究被选为NPR亮点,申请国家发明专利6项。


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