CAG重复序列而非polyQ决定亨廷顿病发病年龄

本文获“BioArt”授权转载，版权归“BioArt”所有，任何转载需获得“BioArt”授权。

温馨提示：在亨廷顿疾病研究领域，传统观点都认为polyQ长度和致病蛋白的水平对疾病起病和发展非常重要，而近日在线的Cell以极具颠覆性的标题对上述结论加以否定，为此，BioArt特别邀请了两位相关领域权威专家对该文章进行了点评，并提出一系列有待商榷的问题，供读者参考。

亨廷顿病是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病，其起因是第四对染色体上的Huntingtin（HTT）基因第一个外显子内CAG三个核苷酸序列大量异常重复，其重复次数在40以上。该序列编码产生含有多聚谷氨酰胺的蛋白（polyQ），后者可在细胞内异常聚集、形成不可溶的蛋白沉淀，导致纹状体和基底核内神经细胞死亡。除亨廷顿病外，CAG序列重复所导致的PolyQ疾病还包括小脑共济失调、肯尼迪病（脊髓延髓肌肉萎缩症）、齿状核红核苍白球路易体萎缩症等。目前而言，亨廷顿病有早发（二十岁以前）和晚发（四五十岁左右）两种，其发病年龄的主要决定因素是CAG重复序列的重复次数。然而，这一决定因素仅能够解释60%左右的发病时间差异，其模型仍有缺陷——即不能够被CAG重复次数所解释的发病时间差异。2015年，Genetic Mmodifiers of Huntington's Disease(GeM-HD)Consortium在4082名亨廷顿病患者中利用全基因组关联分析（GWAS）对这一残差进行了研究，结果显示两个基因位点的三种SNP可能对发病时间产生影响，这两个基因位点主要参与DNA结构维持和线粒体调控当中。

2019年8月8日，GeM-HD协会在Cell杂志上发表长文CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset，通过扩大样本量，对逾9000名亨廷顿病患者再次进行了GWAS分析，发现了能够显著影响发病年龄的罕见SNP位点及对发病年龄影响较小但更为常见的SNP位点。同时，该研究还矫正了常规方法——以PCR产物测序估算HTT基因内CAG重复次数的方法——可能造成的对CAG重复次数的错估，并首次证实关键细胞内的CAG重复次数、而非polyQ重复次数所导致的细胞毒性是决定患者发病年龄的主要因素。此外，该研究还揭示DNA结构维持是调控亨廷顿病发病年龄的主要通路，该通路内的基因的SNP可能通过影响HTT基因内CAG重复序列的扩展而调控疾病发生。

全基因组关联分析首先在四号染色体HTT基因附近发现了两个对发病年龄差异有较大影响的SNP：rs764154313和rs183415333，前者导致疾病早发，后者则导致疾病晚发。由于正常人脑的数据显示，HTT基因的mRNA表达水平个体差异较大，能够显著影响mRNA表达水平的顺式eQTL位点与GWAS SNP位点并无相关性；此外，HD患者中polyQ表达水平显著升高者的发病年龄与杂合子并无显著差异，因此，这两个SNP不是通过影响HTT基因的mRNA表达水平而调控发病的。

作者对HTT基因的CAG重复序列进行了分析，绝大部分欧洲HD患者的CAG重复序列以（CAG）42-（CAA-CAG）1-CCG-CCA结构为结尾，SNP rs764154313者缺少CAA-CAG序列，其结构为（CAG）42-CCG-CCG，因此，传统的PCR产物测序法会低估此SNP处的CAG重复次数（42低估为40）；rs183415333者CAA-CAG序列重复，表现为（CAG）42-（CAA-CAG）2-CCG-CCA结构，这将导致PCR法对CAG重复次数的高估（42高估为43或44）。当这一错估被调整后，rs764154313和rs183415333则不再显著影响HD发病年龄。由于CAG、CAA均可编码谷氨酰胺，作者还利用SNP rs764154313和rs183415333对CAG重复次数和谷氨酰胺重复次数对HD发病年龄的影响进行了探讨。结果发现，仅CAG重复次数可以影响HD发病年龄，CAG以外的核苷酸编码的polyQ并不对HD发病产生影响。

图：CAG的重复次数、而非polyQ的重复次数是决定患者发病年龄的主要因素

此外，GWAS分析还显示一些参与到DNA错配修复、同源重组修复通路的基因如MLH1、FAN1、PMS1、MSH3/DHFR、PMS2、LIG1的SNP能够影响HD的发病年龄，这些基因通过维持染色质结构、影响CAG重复序列的进一步扩展，从而影响HD的疾病进程。

近期由GeM-HD小组发表的论文研究了亨廷顿病（HD）领域一个非常重要的问题：病人的起病年龄是被怎样的遗传因素所影响？这个问题的答案将揭示疾病发病的机制以及可能的治疗靶点，因此具有极为重要的意义。该论文也延续了该小组2014年的主要研究方法，直接从大量病人的遗传学数据出发获得结论，相比传统的依赖于动物模型的研究可能在接近病人临床的方面更具说服力。此外，该论文的思路表面上看也非常的巧妙和优美。然而，该论文的逻辑和结论并非无懈可击，而文章的标题比较颠覆，可能会导致一些误解。

基于多个实验室大量数据的传统观点都认为polyQ长度和致病蛋白的水平对疾病起病和发展非常重要，这篇论文其实也没有否定这个观点。 按这篇论文的发现，疾病的可能机制是，连续的CAG重复可能造成体细胞中CAG重复数扩增，导致部分体细胞中变异HTT蛋白的polyQ过长，最终还是通过polyQ蛋白导致疾病发生发展。只是一开始突变的HTT基因本身中，同样表达Q的密码子CAA，由于不能参与CAG的扩增，对疾病发病可能贡献较小。该论文其实完全没有测量体细胞（包括神经细胞）中HTT的polyQ长度以及水平，因此，论文的标题直接说polyQ长度不影响发病年龄不太准确，容易引起误读。此外，论文逻辑本身有如下值得商榷的地方：

1.作者一开始的推理基于HTT基因的表达水平不影响起病年龄。这点结论其实就与很多数据不符。作者的依据主要有：a. 其它影响HTT表达的HTT基因本身或附近的SNP（cis-eQTL SNPs）没有显著影响起病年龄；b. 纯合HD病人（也即两个HTT均具有过长的CAG重复）的起病年龄与根据杂合HD病人预测的起病年龄基本一致。论据a中的那些SNP没有显著影响起病年龄可能性有很多，比如它们连锁了抵消它们作用的其它SNP，再比如有那些SNP的病人集中在某些地区，对起病年龄的记录有偏向性，或者有其它环境因素影响了起病年龄。此外，也有可能带这些SNP的病人数的不足以得到足够的统计学power，导致无法得到显著结果。至于第二点论据，HD的纯合病人非常至少，可以看到论文中依据的Figure S2F中纯合病人一共才~40个，不足以得到准确分布。此外，纯合病人中可能有各种负反馈机制，包括一些非疾病因素影响了起病年龄的统计。例如纯合病人的父母必定都是病人，他们可能对子女得病有较大预期，因此寻求医疗并汇报起病可能会偏晚等等。因此以上两个都是间接证据，不足以说明HTT表达水平不影响起病。实际上，病人神经元模型、人类遗传学、多种在体动物模型中的大量研究都证明HTT表达水平对疾病神经元存活及表型发作年龄及严重程度都有影响。

2. 其次，作者没有直接证明rs764154313，rs183415333或者其连锁的CAA-loss及CAACAG duplication突变不影响polyQ蛋白的表达。可以想象CAA本身可能影响蛋白翻译或者这些SNP连锁了其它影响HTT表达的SNPs。作者得出CAA不影响疾病起病的结论也与多个动物模型中的研究有矛盾。例如基于CAGCAA的BACHD模型并无连续多个CAG重复，但有明显表型。在人类细胞中有类似结果。

3. 论文的推理多依赖于p值变化，而非起病年龄偏离的程度。例如rs764154313和rs183415333经过只考虑连续CAG重复数的修正后，还有是有显著性的p值（5.0E-8和2.2E-5），只是p值变大了。这是否足以说明之前的显著性完全来自于对连续CAG重复的错误估计？是否连续的CAG重复和polyQ长度对起病年龄都有影响？此外，作者推理水平不影响起病年龄，依据cis-eQTL对表达的影响的p value与它们影响发病年龄的p value无关，这里应该用影响程度更为合理。

4. 一个容易忽视的问题起病年龄汇报的准确性。如果具有某些SNP的病人集中在某些地域，而这些地方对起病年龄的汇报有偏向性，那么容易得到错误的结论。

5. 起病年龄并不等同于发病的全部。也有这样的可能，polyQ长度决定了起病后疾病发展的速度，而连续的CAG重复数决定了起病的年龄，两者共同参与疾病发生发展。

最后，最重要的是，这个研究不应解读为致病蛋白变异HTT中polyQ的长度不重要或者polyQ致病蛋白水平不重要。如前所述，该论文只是说明CAA由于无法参与CAG扩增，其对起病年龄影响可能不明显，疾病最终很可能还是通过进一步扩增CAG表达的具有含有进一步扩增的polyQ的HTT蛋白导致。

起病年龄肯定不单单是由polyQ蛋白决定，修饰调控基因肯定对发病年龄有重要作用。但是长期大量研究表明polyQ的长度扩增是疾病的主要驱动因素，因此我们很难相信其它的单个或多个修饰基因会取代polyQ在疾病发展中的作用。论文有如下几点值得商榷的地方：

1. 这篇论文有一个很强的结论是纯合HD病人的起病年龄与杂合HD病人类似，并由此推断HD发病与polyQ水平无关。这个结论需要更多的依据和病人数量。特别是考虑到起病年龄可能与polyQ水平和其它多种因素都相关。

2. 起病年龄与疾病发展两者可能对HD的衡量和HD治疗策略的研发都很重要，其中哪个更重要？就大多数情况而言应该是后者。本论文作者没有解释，但是仅基于起病年龄分析，这样给人一个印象CAG重复而非polyQ蛋白对HD最重要。作为读者我们不应该误读出这样的结论。

3. 小鼠动物模型中有很强的证据表明polyQ的长度，不管是由纯粹的CAG表达还是有CAGCAA混合序列表达，均会对起病年龄和HD相关症状有明显作用。

4. 论文主要依据的数据在论文的图2中，主要使用了40-55 CAG repeats的小样品量的HD病人。这个重复数区间中，重复数和起病年龄本身相关性就比较弱，没有一个清晰的相关性，如果导致错误结果。图2C中纯CAG和CAACAG混合序列的趋势也没有明显区别。

5. 其它的数据主要展示了一些对HD起病年龄的其它修饰基因。这篇论文提出了个重要的问题，如果polyQ蛋白本身不重要，那么是否影响这些修饰基因比降低polyQ蛋白本身的水平或者组织其错误折叠更重要？这似乎不太可能，我们拭目以待。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.06.036