定向进化技术实现对脂肪酶四种立体选择性的调控

由于不同的对映异构体可能具有不同的生理活性，甚至可能存在严重的毒副作用，因此分子手性与其生物活性之间的关系受到人们广泛的关注。而随着分子中手性中心的增加，两者之间关系的复杂性会急剧增加。虽然不对称合成技术在过去几十年中得到了极大的发展，但是对于反应过程中立体构型的控制，特别是实现多手性中心化合物的每一种构型产物的合成，仍然是一个巨大的挑战。

酶催化的立体多样性合成方法的研究相对于其他酶催化研究领域而言，发展相对缓慢。究其原因是天然酶的专一性比较高，因此很难利用同一种酶来实现对一个多手性中心化合物的每一种构型产物的合成。虽然酶的定向进化技术已经在调控酶的立体选择性方面得到了广泛应用，但是立体选择性多样化的酶定向进化研究则很少有报道。

最近，浙江大学化学系的吴起副教授课题组与德国马普煤炭所的Manfred T. Reetz教授、上海有机所周佳海研究员以及英国贝尔法斯特女王大学的黄美兰博士合作，以南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B, CALB）催化的有机相中外消旋酸和外消旋醇的酯交换反应为模型，利用一种基于定向进化和理性设计相融合的高效的蛋白质工程改造策略——“Focused Rational Iterative Site-specific Mutagenesis” (FRISM)，以极小的突变株筛选工作量，得到了分别对四种构型产物具有高度立体选择性的CALB突变株，目标构型的选择性都在90%以上，晶体结构解析和非水相的分子动力学模拟计算较好地解释了四种突变株的特定立体选择性的产生原因和分子机制。文章近日发表在J. Am. Chem. Soc.上。

图1：基于FRISM的突变库构建策略。图片来源：JACS

图2：由CALB突变株催化的2-苯基丙酸对硝基苯酚酯和1-苯乙醇之间的酯交换模型反应。图片来源：JACS

图3：利用FRISM得到的四种CALB突变株对模型反应的不同选择性。图片来源：JACS

利用FRISM技术，在筛选的关键氨基酸位点引入A/L/F作为不同体积大小的氨基酸突变，根据最佳突变再加入少许相似大小的氨基酸作为扩展（A⁺: G; L⁺: V/C/I/M; F⁺: Y/W），每种选择性的突变库中突变株数量不多于25个，可以高效地实现对所有四种可能的立体异构体都达到了>90%的选择性。在四种选择性突变株的底物谱研究中发现突变株S_acidR_alco、R_acidS_alco与R_acidR_alco都具有较宽的底物适用性，而突变株S_acidS_alco的底物谱相对比较窄。

表1：四种CALB突变株的底物谱。图片来源：JACS

在对野生型CALB以及四种不同立体选择性突变株的动力学对比分析中，发现野生型CALB对（R_acid, R_alco）和（S_acid, R_alco）构型的底物有相似的活性，而对于（R_acid, S_alco）和（S_acid, S_alco）构型的底物活性很低，说明了野生型CALB对手性仲醇的严格选择性起到了重要的作用。而另一方面，每个突变株的动力学参数也说明了其本身明显的构型选择优势。为了更好的理解不同构型底物与特定蛋白质之间的关系，研究者对四种突变株蛋白进行结晶，得到的结构表明在不同的突变株中，对醇结构或者酸结构有相同选择性的晶体结构也表现出相似的蛋白选择性口袋形状。

最后，研究者在解析四种突变体晶体结构的基础上，利用分子动力学模拟阐述了四种突变株不同选择性的来源。在同一突变株中，底物分子的羰基C原子与CALB的催化中心105位丝氨酸的羟基O原子的最短距离都证明是最优构型的距离。同样的结果在计算得到的结合焓中也得以体现，结合焓越小，此突变株对特定构型的选择性越大。

本文通过理性设计和定向进化的有机结合，调控活性位点中关键氨基酸的某一特性（本文中以A/L/F作为调控氨基酸体积大小的突变），在单位点筛选结果基础上，进一步进行理性设计的多位点组合迭代突变，构建高度聚焦的小型突变库，实现了对4种手性选择性的分别调控。该方法仅需最小量的筛选，大大减少了工作量，相比于饱和突变，更加突显出人工理性设计策略的重要以及先进性，为以后酶的立体多样性定向进化提供了借鉴。该文章的共同第一作者是浙江大学化学系的博士生徐鉴和岑一欣。周佳海研究员、黄美兰博士、Manfred T. Reetz教授和吴起副教授为共同通讯作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Stereodivergent Protein Engineering of a Lipase To Access All Possible Stereoisomers of Chiral Esters with Two Stereocenters

Jian Xu, Yixin Cen, Warispreet Singh, Jiajie Fan, Lian Wu, Xianfu Lin, Jiahai Zhou,* Meilan Huang,* Manfred T. Reetz,* Qi Wu*

J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 7934-7945, DOI: 10.1021/jacs.9b02709

导师介绍

周佳海

https://www.x-mol.com/university/faculty/15579

吴起

https://www.x-mol.com/university/faculty/14407