Angew：“蓝瘦蘑菇”受伤后的魔幻变色秀

大家都知道，“蓝瘦香菇”并不是一种香菇，这个过气网络流行语如果翻译成今年的网络流行语，就是——我太“南”了。

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但实际上，自然界中也真有类似的“蓝瘦蘑菇”——瘦瘦长长的古巴光盖菌（Psilocybe cubensis，图1左），当它受到擦伤或割伤时，其子实体受伤部位会立即变蓝（图1右）。

图1. 左：古巴光盖菌（Psilocybe cubensis）结构，右：古巴光盖菌（Psilocybe cubensis）被割伤后子实体迅速变蓝。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

变蓝只是这种蘑菇的魔术之一。古巴光盖菌还含有强烈神经致幻剂赛洛西宾(psilocybin，1），人食用后，所含赛洛西宾上的磷酸酯会被磷酸激酶PsiK剪切掉形成psilocin（2）。后者是真正的精神活性化合物，能够通过竞争性结合五羟色胺受体严重干扰人的感知系统。

图2. Psilocybin（1）和psilocin（2）的结构。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

那么，在古巴光盖菌的魔幻变色中，化合物1、2是否扮演了某种角色？或者说此类变色秀中，蓝色色素的结构、生色基团和生化基础是什么？这同样是一些很“南”的难题，困扰了天然产物化学界几十年。最近，德国Hans Knöll Institute（HKI）的Dirk Hoffmeister教授（图3）团队迎难而上，在Angew. Chem. Int. Ed. 报道了他们在这个领域的研究成果。

图3. Dirk Hoffmeister教授。图片来源：HKI ^[1]

以往文献中报道的氧化实验结果表明，是化合物2而非1转化为蓝色色素。所以，他们推测生色基团可能是由2衍生的邻位耦合二芳基乙二酮，且芳基偶联反应前可能存在稳定的自由基，催化该反应的酶可能是细胞色素P450、或黄素依赖型单加氧酶、或漆酶。由于存在磷酸酶，化合物1可能在古巴光盖菌的快速变蓝反应中，依次经过去磷酸化、氧化和寡聚化。

为验证上述推测，他们从古巴光盖菌子实体中用生物活性追踪色谱法分离磷酸化酶PsiP和漆酶PsiL。他们将尺寸排阻色谱法（SEC）分离到的有活性组分，经胰蛋白酶消化，用MS/MS的多肽指纹图谱和古巴光盖菌蛋白组学数据库进行分析，筛选出得分最高的磷酸酶PsiP（蛋白质ID 89927）。经生物信息学分析发现其定位于溶酶体。他们以标准品1和2作为对照，用液相色谱质谱联用技术（LCMS）发现PsiP能够将1去磷酸转化为2（图4）。他们再用类似方法分析有氧化活性的组分，鉴定出含多铜的氧化酶PsiL（蛋白质ID 71514），进一步研究发现，它是一个催化自由基氧化反应的漆酶，定位于细胞外。光度测定法发现PsiL能够氧化化合物2而非1，并使之变蓝（图4）。所以，他们认为酶促反应是由PsiP启动PsiL跟进的，能够使化合物1转化为以2为单体基础的多聚体显色物质。

图4. A：标准品1和2的LCMS图谱（上），SEC活性组分加入PsiP后，1减少、2出现并增加（中），SEC活性组分加入高温变性PsiP后的图谱，1没有变化、2没有出现（下），B：SEC组分和HIC（疏水作用色谱分离）组分分别加PsiL的光吸收情况，阴性对照是HIC组分加入高温变性的PsiL。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

为深入分析化合物2氧化和变色机理，他们将PsiL相似模型反应分为非酶促（Fe III）反应，酶促（漆酶/O₂或辣根过氧化物酶HRP/H₂O₂）反应分别进行研究。发现每种反应中化合物2的量都会下降并伴随颜色变蓝，且在定性和定量上没有显著差异。然而，酶促反应生成的色素大多吸附在蛋白上用色谱难以分离。质谱分析得到的信号非常复杂，但有质荷比（m/z）202的倍数信号，如2的二氢二聚体（m/z 407）和二脱氢二聚体（m/z 405）的出现（图5）。同时，对含蓝色色素的组分进行红外（IR）光谱分析显示，组分中物质有羰基官能团，较高的结构不均一性和聚合度。质谱和红外分析，结合可逆性的Fe III介导的氧化还原化学表现，暗示组分中有双吲哚内酯醌类产物的形成。

图 5. LCMS分析漆酶催化2的氧化和伴随形成或减少的醌型或氢醌型二聚体（m/z 405-407）。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

随后，他们用漆酶/O₂体系处理2并稀释后加入到液相色谱质谱（LCMS）中进行分析显示，2逐渐被消耗掉伴有蓝色立即形成，随着时间推移，大量的高聚物出现。为了便于比较，他们同时用LCMS研究2的自氧化过程，发现组分颜色由浅绿发展到灰褐色或棕色，并检测到的质荷比为219（2 + [O] - 2[H]）、419（二聚体 2 +[O] - 6[H]）、621（三聚体2 + [O] - 8[H]）的信号，显示化合物2产生的自由基被亲核进攻产生上述化合物，其自氧化机理与酶促反应不同。

为进一步监测混合物2的酶促反应过程，Dirk Hoffmeister教授团队借助原位核磁（in situ NMR）图谱进行分析。通过逆门控去耦合（igd）¹³C NMR 技术，他们发现使用辣根过氧化物酶 (HRP)/H₂O₂处理2时，其侧链碳（Me, C-1', C-2'）受影响最小，吲哚核上的碳信号显著下降，六元环上次甲基碳信号受到影响最大（C-6 > C-5 > C-7），且有新信号观察到（dd 或 t 峰，

δ=123.1 ppm）。他们推测化合物2的二聚体化主要是通过C5位的偶合，其次是C7位，而C5和C7位新形成的碳碳键显著影响了C6的信号，使后者核磁信号下降并形成新信号（图6）。

图6. 用原位¹³C 核磁图谱检测2在二聚体化时的碳信号强度，不同位置用不同颜色表示，“new”指正在出现的新信号，如C6。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

基于上述实验结果。他们得出结论，古巴光盖菌受伤时产生的自由基中间体是半醌类化合物。但是蓝色色素不是以单体而是以寡聚体形式存在。化合物1在磷酸化酶PsiP的催化作用下C4位去磷酸形成羟基生成2。化合物2在漆酶PsiL催化下C4氧化脱氢形成中间体2x，两个2x通过C5-C5偶合形成无色二氢二聚体5，5和蓝色醌型二聚体6可以通过氧化还原方式互变。同时，二聚体寡聚化或者多聚化可以形成无色多氢多聚化合物7或9，7或9能与蓝色醌型多聚体8或11通过氧化还原作用互变（图7）。这就是此类蘑菇变蓝的秘密。

图7. 古巴光盖菌中由PsiP和PsiL催化的变蓝反应，自由基2x中的稳定电子位置用红色标记。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

在大自然中，蘑菇受伤产生的这类天然产物可能起到了化学防御的作用，能够保护自己并干扰摄食者的行为。这种快速发挥作用的化学防御策略需要稳定的前体和相关酶在空间上分隔。具体到古巴光盖菌的例子，化合物1和PsiL（定位于细胞外）、PsiP（定位于溶酶体）就存在空间分隔，以自我保护并防止在完整细胞中发生化合物多聚化和致命的蛋白交联。这些由化合物2产生的寡聚和多聚体在摄食昆虫肠道碱性和氧化环境中，会产生活性氧进而损坏肠道发挥毒性作用。

至此，“蓝色香菇”的魔幻变色谜题解开，其实是这类蘑菇受伤后产生的化学防御反应。其化合物2的寡聚或多聚体是蘑菇显蓝色，发挥防御作用的基本因子。读到这里，笔者不免要感慨：蘑菇遇到“难题”，也并非一味的“蓝瘦”，而是迅速行动起来，拿出应对策略。我们人类作为食物链的顶端生物，是否也应该在“蓝瘦”中振作起来，越挫越勇，积极应对呢？

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Injury-Triggered Blueing Reactions of Psilocybe “Magic” Mushrooms

Claudius Lenz, Jonas Wick, Daniel Braga, María García-Altares, Gerald Lackner, Christian Hertweck, Markus Gressler, Dirk Hoffmeister

Angew. Chem. Int. Ed., 2019, DOI: 10.1002/anie.201910175

参考资料：

1.https://www.leibniz-hki.de/en/pm-staff-details.html?member=73

（本文由水村山郭供稿）