pClick：临近诱导抗体偶联为抗体标记领域注入新的活力

免疫球蛋白可对靶点进行特异性结合，广泛用于生物医学领域。人们最初通过小分子反应标记抗体蛋白，例如赖氨酸末端氨基的非特异性酰化反应或者用马来酰亚胺修饰色氨酸。但由于小分子反应的不可控性，这些修饰后的抗体蛋白往往对靶点的结合能力有所减弱，不适合医学应用。随着生物正交化学和蛋白质工程的发展，一些新的对抗体蛋白特异性修饰的方法由此产生，例如通过对抗体蛋白的基因修饰在抗体蛋白上插入非自然氨基酸或是功能性多肽链使其可与小分子特异性结合。然而这些方法需要对抗体蛋白进行基因修饰，效率较为低下。抗体蛋白修饰的另一个方向是通过光催化诱导抗体与功能性多肽偶联，但是由于紫外激发会导致蛋白质损伤，并且光催化难以控制，该方向目前也没有很大的进展。

图1. 通过临近诱导效应偶联抗体蛋白与功能性蛋白

为了克服上述问题，Xiao教授（点击查看介绍）及其团队巧妙设计了一种无需基因修饰标记抗体的新方法pClick。pClick利用抗体蛋白与其亲和蛋白自发结合的特性，通过临近诱导效应高效、高特异性标记抗体蛋白。为了避免干扰抗原结合区段和可结晶区段的结合位点，他们在蛋白质A中截取一段蛋白（FB），利用改造过的tRNA合成酶/tRNA将非天然氨基酸加载到蛋白序列中无义密码子对应位置的方法来插入具有临近诱导偶联功能的非天然氨基酸，当FB蛋白与抗体蛋白结合时，该非天然氨基酸会接近抗体蛋白表面的特定赖氨酸并发生共价化学反应，从而将抗体蛋白与FB蛋白结合在一起。为了提高FB蛋白与抗体蛋白的偶联效率，他们尝试在FB蛋白上的多个位点插入非自然氨基酸，并对抗体蛋白与FB蛋白的反应比例与反应时间进行优化，最终将对免疫球蛋白G的偶联反应效率提高到95%以上。值得一提的是，这一利用临近诱导抗体蛋白偶联的新方法具有普适性。实验表明，对于人类和小鼠的多种免疫球蛋白都能达到95%以上的偶联率。

图2. 通过临近诱导效应用荧光基团标记免疫球蛋白及其普适性和特异性研究

为了探究这一新方法在生物领域中的应用，他们通过在FB蛋白上连接荧光基团的方法来标记抗体蛋白。首先，他们通过对FB蛋白基因修饰，将一个苯丙氨酸位点变异成色氨酸，然后通过马来酰亚胺修饰色氨酸将荧光基团偶联到FB蛋白上。带有荧光基团的FB蛋白随后与免疫球蛋白G按照8:1的摩尔比例混合，在37 ℃下放置两天。荧光基团标记的免疫球蛋白G分别与Her2阳性与阴性细胞混合固定后，通过激光扫描共聚焦显微镜观察免疫球蛋白G对Her2的特异性结合能力。实验表明，只有Her2阳性的细胞表面有荧光反应，从而证明了利用临近诱导效应标记免疫球蛋白的可行性。这一成果得到包括Medical Express、TMC News、FUTURITY、EurekAlert!在内的多个医学前沿新闻媒体报导和转载。目前Xiao教授及其团队正在尝试通过固态合成FB蛋白的方法将更多的功能性基团偶联到抗体上，并提高抗体标记的灵敏性。相关研究发表在Bioconjugate Chemistry上。

该论文作者为：Chenfei Yu, Juan Tang, Axel Loredo, Yuda Chen, Sung Yun Jung, Antrix Jain, Aviva Gordon and Han Xiao

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Proximity-Induced Site-Specific Antibody Conjugation

Bioconjugate Chem., 2018, 29, 3522, DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.8b00680

导师介绍

Han Xiao教授本科毕业于中国科学技术大学化学系，师从龚流柱教授，研究生毕业于Scripps化学系Prof. Peter G. Schultz实验室，随后在斯坦福大学化学系Prof. Carolyn R. Bertozzi实验室从事博士后研究工作。其相关研究工作发表在Proc. Natl. Acad. Sci. USA、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed. 等期刊，共发表共同作者文章及专利20多篇。2017年，Xiao教授加盟全美顶尖私立大学莱斯大学（Rice University），课题组的研究方向包括生物正交化学反应、蛋白质化学修饰、蛋白进化、抗体偶联、化学生物学以及相关交叉学科，欢迎具有相关背景的人士联系加盟。

Han Xiao

http://www.x-mol.com/university/faculty/49804

实验室主页

http://xiao.rice.edu

Chenfei Yu本科毕业于中国科学技术大学化学系，现为莱斯大学化学系二年级博士生。