Angew. Chem.：新型三维类雷帕霉素小分子芯片助力膜蛋白小分子调节剂的研发

近日，约翰霍普金斯大学医学院药理与分子科学系刘钧（Jun O. Liu）课题组发表题为“利用新型三维类雷帕霉素小分子芯片研发葡萄糖转运蛋白抑制剂（Discovery of a Potent GLUT Inhibitor from a Library of Rapafucins by Using 3D Microarrays）”的研究论文, 通过将类雷帕霉素 (Rapafucins) 文库打印到新研发的三维小分子芯片，开发出葡萄糖转运蛋白（GLUT）的活性小分子抑制剂RgA；RgA能有效地抑制葡萄糖吸收、引起细胞凋亡、并抑制人乳腺癌细胞在小鼠动物模型上的生长。该研究不但阐明了Rapafucins文库在新药和工具分子研发方面具有广阔的前景，也为今后膜蛋白的药物筛选与开发提供一种新的技术模式。

葡萄糖是细胞最主要的能源物质，不仅为生长代谢提供能量，而且作为前体参与合成大分子。葡萄糖由于本身亲水的性质无法通过疏水的细胞膜自由进出细胞，其运输过程需要依靠膜上的转运蛋白完成。葡萄糖转运蛋白GLUT家族成员（目前已知14个），特别是GLUT1，在转运过程中扮演着至关重要的作用。已有研究表明，相对于正常细胞而言，快速生长的肿瘤细胞为满足它们对能量的需求会上调GLUT1的表达。抑制肿瘤细胞的葡萄糖转运蛋白不但能抑制细胞生长，还能使其对其它药物变得敏感。近年来，GLUT1作为肿瘤治疗靶点备受人们关注。

刘钧教授研究组于今年初在《自然-化学》发表研究论文，首次报导了类雷帕霉素小分子文库的设计、合成、筛选与应用（Nat. Chem., 2019, 11, 254-263）。类雷帕霉素小分子文库的设计灵感来自于天然产物雷帕霉素与FK506。两个化合物通过类似的FKBP 结合结构域(FKBD)与蛋白FKBP12 结合，形成二元复合物后再利用完全不同的效应结构域(effector domain) 结合各自的靶标蛋白mTOR 和Calcineurin，形成三元复合物后发挥抗肿瘤和免疫抑制的作用。这种特殊的作用机制使得它们具有更好的稳定性、更高的细胞内富集、更优越的药代动力学和药效动力学等成药优势。根据这两种天然产物的特性，作者通过组合肽库替换雷帕霉素的效应结构域构建了含45000个类雷帕霉素小分子的文库。类雷帕霉素小分子具有雷帕霉素和FK506 的成药优势，更有机会成功发展成为小分子药物，在药物研发领域具有更好的前景。通过对该文库的高通量筛选，作者鉴定了一系列新型抑制剂，其中包括核苷酸转运蛋白1 (ENT1) 抑制剂Rapadocin。Rapadocin不但有着类似于雷帕霉素和FK506的作用模式，而且在小鼠动物模型中能有效抑制肾缺血再灌注损伤。该研究证实了从Rapafucins中寻找膜蛋白，特别是溶质转运蛋白家族成员调节剂的可行性。由于ENT1和GLUT1同属于溶质转运蛋白家族成员，作者决定以葡萄糖转运蛋白GLUT1为例，在Rapafucin文库中寻找新型抑制剂。

近年来，越来越多的文献报导小分子芯片是基于靶标的高效活性小分子发现的强有力手段。作者选择在芯片上引入光交联基团diazirine，经光交联反应后生成活性卡宾分子共价结合类雷帕霉素小分子芯片。和二维芯片不同的是，三维芯片的表面结构是通过在玻璃表面上生长聚合物而形成的，每个聚合物链最多可承载数百个diazirine基团，因此可显著增加类雷帕霉素小分子的结合数量。作者优化了三维芯片聚合物生长时横向和纵向交联剂的比例，发现优化后的三维芯片平均信噪比强度是二维芯片的6倍以上。随后，在HEK293T细胞上过表达GLUT1，接着用detergent DDM把GLUT1从膜上溶出来，然后直接拿细胞裂解物作用于类雷帕霉素小分子芯片上。经过筛选和验证，作者找到了两个潜在的GLUT1抑制剂，并把其中活性最高的命名为Rapaglutin A (RgA)。

为了进一步验证RgA的作用方式和作用机制，作者证实RgA在体内可以作用于GLUT 1，3和4。作者还发现RgA的抑制作用不受高剂量FK506和雷帕霉素的影响，也不受FKBP12、51或者52蛋白敲除的影响，表明了RgA的抑制作用不具有FKBP依赖性。作者和杜克大学Jason Locasale研究组合作，发现RgA短期处理过后，细胞的葡萄糖前期代谢产物有明显的降低，三羧酸循环和氧化还原状态则没有明显变化，进一步表明了RgA作用于葡萄糖代谢的前期。

最后，作者利用人乳腺癌肿瘤移植小鼠模型进行了RgA抗肿瘤活性的体内实验。实验结果表明，经过1个月的给药，2 mg/kg RgA的处理组较对照组明显减轻肿瘤大小，表明RgA的抗肿瘤活性在体内有效。同时，处理组与对照组的体重对比没有明显变化，说明2 mg/kg的剂量在小鼠的耐受范围之内，没有毒性。这些结果表明了葡萄糖转运蛋白新型抑制剂RgA有作为抗乳腺癌的药用前景。

相关工作发表在Angew. Chem. Int. Ed.上，文章的共同第一作者是Zufeng Guo、Zhiqiang Cheng和Jingxin Wang博士。

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Discovery of a Potent GLUT Inhibitor from a Library of Rapafucins by Using 3D Microarrays

Zufeng Guo, Zhiqiang Cheng, Jingxin Wang, Wukun Liu, Hanjing Peng, Yuefan Wang, A. V. Subba Rao, Ruo‐jing Li, Xue Ying, Preethi Korangath, Maria V. Liberti, Yingjun Li, Yongmei Xie, Sam Y. Hong, Cordelia Schiene‐Fischer, Gunter Fischer, Jason W. Locasale, Saraswati Sukumar, Heng Zhu, Jun O. Liu

Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58, 17158-17162, DOI: 10.1002/anie.201905578