MicroRNAs（miRNAs）作为新型的肿瘤生物标志物的代表，是一类长度约为21个核苷酸的进化保守、内源性表达和非蛋白编码的RNA，其准确检测对辅助诊断和预后评估癌症具有重要意义。近年来，具有π共轭结构的有机半导体纳米材料通过π-电子相互作用界面与核酸探针有效地对接，在基于纳米猝灭剂的荧光核酸传感方面具有巨大的应用前景。然而，目前的纳米猝灭剂难以实现有效的π电子离域和电荷分离，从而促进更多的分子间电子耦合和更优异的荧光猝灭。
2021年8月26日，本课题组在《ACS Applied Materials & Interfaces》杂志在线发表题为 “Interfacial Engineering of Hybrid Polydopamine/Polypyrrole Nanosheets with Narrow Bandgaps for Fluorescent Sensing of MicroRNA”的文章，硕士研究生杨梦楠为论文第一作者。在此，该研究报道了具有π电子耦合和窄带隙的二维纳米猝剂用于miRNA荧光传感的概念验证设计。具体而言，基于课题组曾报道过的衬底材料，即采用DNA为结构导向剂，构建具有垂直交错和横向填充的主平面结构的聚多巴胺纳米片(PDA-NS)。随后，吡咯(Py)单体通过π-π堆积作用和氧化剂（Fe3+）诱导聚合在纳米片上进行杂交、复合，构建出一种新型的纳米猝灭剂。通过对聚合物在二维界面上的复合设计，实现了低至0.29 eV的超窄带隙。利用荧光染料标记的ssDNA作为探针，复合纳米猝灭剂(PDA-PPy-NS)表现出超高的荧光猝灭能力，即在完全猝灭条件下，Cy5-ssDNA/纳米猝灭剂的质量比为36.9，与氧化石墨烯相当。结果表明，纳米片与核酸染料（Cy5）的能级耦合是促进光诱导电子转移(PET)的关键因素。随后，基于PDA-PPy-NS纳米猝灭剂构建生物传感器，发现该传感器具有较低的检测限（23.1 pM）和较高的选择性。该平台可以极大地提高我们构建超窄带隙的荧光纳米传感器的能力，从而抑制荧光背景干扰和实现优异的传感性能。
【图文导读】
图1. 基于Cy5-ssDNA/PDA-PPy-NS的纳米传感平台示意图。
图2 纳米片的形貌表征：（a, e）PDA-NS,（b, f）PDA-PPy-0.39-NS,（c, g）PDA-PPy-0.68-NS,（d, h）PDA-PPy-0.97-NS的AFM（基底：云母片；白色插图：高度分布）和TEM图像（插图：(h)中选定区域放大的TEM图）。
图3 纳米片的组成特征：(a) zeta电位，(b) 拉曼光谱，(c) XPS光谱。(a)中的误差棒表示三次独立测量值的标准差。A-D分别代表PDA-NS、PDA-PPy-0.39-NS、PDA-PPy-0.58-NS和PDA-PPy-0.97-NS。
图4 纳米片的光物理和电化学性能：(a) 在水溶液中，纳米片（60 µg mL-1）的UV-vis/NIR吸收光谱；(b) 在665nm处的的消光系数；纳米片固体粉末的(c) UV-vis/NIR吸收光谱和(d) 漫反射光谱(DRS)；(e) 循环伏安曲线 (CV)；(f) 能带结构示意图。
图5 (a) MS曲线，(b) 电化学阻抗谱(EIS)、(c) 电子顺磁共振谱 (EPR)。
图6 (a) 645 nm波长的泵浦光激发下，Cy5（上）和Cy5/PDA-PPy-0.97-NS（下）的时间分辨瞬态吸收光谱图；(b) 不同时间延迟下，Cy5和Cy5/PDA-PPy-0.97-NS的瞬态吸收光谱；(c) Cy5和Cy5/PDA-PPy-NS在650 nm处的光激发载流子动力学，两条曲线均进行了三指数函数衰减拟合；(d) Cy5/PDA-PPy-0.97-NS复合物的光物理过程示意图；(e) Cy5和PDA-PPy-0.97-NS的能级带隙以及PET猝灭过程示意图。
图7（a-d）纳米片（10 µg mL-1）对50 nM Cy5标记的单链(ss)DNA探针（红线）、ssDNA-miRNA异源双链（蓝线）的荧光猝灭动力学和双链、单链核酸的荧光强度比（黑线）：(a) PDA-NS，(b )PDA-PPy-0.39-NS，(c) PDA-PPy-0.58-NS，(d)PDA-PPy-0.97-NS；(e) 用于荧光变化的可视化比较的CLSM图像；(f) 在纳米片（10 µg mL-1）存在下，ds和ssDNA探针的荧光强度比。
图8 (a)不同浓度 (0-15 µg mL-1)的纳米片对50 nM Cy5-ssDNA探针的淬灭效率；(b-d) 检测参数的优化：(b)温度，(c) pH值和 (d) 氯化钠的浓度（F/F0代表在100 nM miRNA存在/不存在的情况下，10 µg mL-1纳米猝灭剂与50 nM探针孵育后的荧光强度比值）。
图9 (a-b) 在不同浓度的miRNA-21存在下，Cy5-ssDNA探针(50 nM)和纳米片和的荧光发射光谱： (a) PDA-NS (40 µg mL-1), (b) PDA-PPy-0.97-NS (10 µg mL-1); (c-d) 在不同浓度的miRNA-21存在下，Cy5-DNA探针(50 nM)和纳米片在665 nm处的荧光峰强度: PDA-NS, PDA-PPy-NS；插图显示了荧光强度(FL)与靶标浓度的校准曲线。
图10 在靶标miRNA-21和不同错配碱基数的miRNAs(100 nM)存在下，通过测量F/F0比值来检测检测系统的特异性：(a)PDA-NS和(b)PDA-PPy-0.97-NS，SM/DM/TM-miRNA-21、let-7a和miRNA-141分别代表单/双/三碱基错配和多碱基错配的miRNA-21。(c)在10 vol%的胎牛血清中，检测标准浓度的miRNA-21（0.1 nM、0.05 nM、0.01 nM）；(d)从MCF-7细胞系提取总RNA用于miRNA-21的实际生物样品检测。
本研究通过PDA和富π电子分子（如核酸，PPy等）之间的界面复合，成功开发出π共轭的二维纳米材料(PDA-PPy-NS)。PDA-PPy-NS具有独特的π电子耦合和π平面叠加结构，为构建窄带隙(0.29eV)、高PET效率的二维纳米材料提供了新的设计方法。更重要的是，进一步验证了可以提高PDA-PPy-NS的荧光猝灭能力，可与氧化石墨烯相当。因此，基于PDA-PPy-NS的生物传感器用于miRNA-21检测，并发现其具有低LOD(23.1pM)和高选择性。综上所述，以上发现为构建高性能传感平台提供了一条新的途径。
https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsami.1c11301