113625
当前位置: 首页   >  课题组新闻   >  《Regenerative Biomaterials》人细胞外基质胶原蛋白(hCol)
《Regenerative Biomaterials》人细胞外基质胶原蛋白(hCol)
发布时间:2024-02-17

     胶原蛋白是人类细胞外基质 (ECM) 中最丰富的结构蛋白,为组织提供支撑并引导组织发育。尽管在组织工程中被广泛使用,但关于胶原蛋白来源的最佳选择仍存在不确定性。动物来源的胶原蛋白存在免疫原性等挑战,而重组系统还不能完全还原天然胶原的全序列和缺乏糖基化修饰。因免疫原性、生物活性、结构复杂以及规模化生产等问题,提供人源化天然胶原仍然存在挑战。

     最近,我们的研究提供了一种量产天然胶原的策略,即由人类细胞产生细胞外基质胶原蛋白(hCol), 相关研究成果发表在《Regenerative Biomaterials》上,题为《Human extracellular matrix (ECM)-like collagen and its bioactivity》。在这项研究中,我们通过诱导细胞分泌胶原hCol并证明了hCol具有天然胶原的层次结构和生化性质。通过详细的证据,hCol能够促进人类脂肪来源的间充质质干细胞(hASCs)的基本生物行为,包括细胞存活、增殖、迁移和促类脂肪细胞表型。此外,它还能促进切皮伤口的愈合。由于其与天然胶原蛋白性能高度相同和具有良好的生物活性,hCol有望成为体外和体内组织工程应用的潜在候选物。

1. 如何确认hCol是天然胶原?

     首先我们在海绵状多孔载体中采用合适的诱导手段,促进骨髓来源间充质干细胞(hMSC)分泌胶原(hCol)。随后,我们将ECM经过纯化和冻干处理,得到了如图1a所示的大量hCol。质谱分析显示hCol主要含有I型胶原,且主要由α1链(132 kDa)和α2链(122 kDa)组成,这与天然牛胶原的组成链(bCol I)相同(图1b和1c)。此外,对糖蛋白组学数据进行分析显示,hCol与天然牛胶原相比,在相同的位点出现糖基化(Ser3、Ser1141和Thr132)且Ser1141的修饰都是最丰富的,而对于N-糖基位点,观察到N1267和N1365同样被修饰(图1e和1f)。这些观察显示hCol具有与天然牛胶原糖基化的相同位点,但因来源不同,其N-糖基结构存在略微不同。

图1.  hCol具有天然胶原的生化性质

     hCol具有与天然胶原相同的分子特征。如图2a所示,hCol和天然牛胶原的FTIR光谱显示酰胺A和酰胺I的相同波数。而酰胺III峰与υ(CH2)峰(在1450 cm-1处)的比值通常用于确定胶原独特的二级结构-三螺旋化的程度,对于这一比值天然牛胶原约为1.0,而在hCol中为0.98,这一结果显示hCol三股螺旋化程度非常接近天然胶原。此外,hCol在816 cm-1的峰显示了脯氨酸残基的羟基化,这对维持生理温度下的胶原三螺旋的稳定性至关重要。另外,hCol的光谱上酰胺I区主要由三螺螺旋结构占据,这与FTIR研究的发现一致(图2c和2d)。圆二色谱也显示hCol具有与天然牛胶原相同的三螺旋结构和相近的结构热稳定性。如图2e和2f所示,天然牛胶原和hCol都在222 nm处有正峰,两组中该峰的转变温度接近且它们的降解温度均高于40˚C,表明hCol种具有与天然胶原相同的且在正常生理条件下稳定的三股螺旋结构。

     此外,hCol还具有天然胶原的独特纤维结构。如图3a所示,hCol中的纤维结构内形成了高度排列的纤维束密集层。分布于溶液中的hCol胶原,具有直径约30纳米的纤维(图3b),这处于文献中报道的胶原纤维直径范围内(20-500纳米)。此外,还观察到在较大直径纤维上存在明暗交替的带状图案(图3c),这与胶原单体的定期排列有关(称为D-周期)。在这里,测得的D-周期约为68纳米,与天然胶原的文献值一致。对于HAADF-STEM图像进行了元素分析,观察到了hCol中的碳和氮元素在纤维上的大量分布(图3d-3f),显示该结构来自蛋白中的纤维。以上所有结果表明,在hCol中形成了天然胶原的高级纤维结构。

图2.  hCol具有天然胶原的分子表征

图3. hCol具有天然胶原的高等纤维结构

2.如何确认hCol的生理功能?

     首先,我们通过CCK-8试验和细胞计数评估了hCol对细胞存活和细胞增殖的影响(图4a)。如图4b所示,在细胞培养基(10μg/mL)中添加hCol后的24小时和48小时内,与空白对照组(仅细胞培养基)相比,人脂肪来源干细胞(hASCs)的存活通过OD 450nm的吸光度表现出增加。随着培养时间的增加,hASCs的数量增加,hCol中细胞数量显著性地比空白组更多(图4c)。此外,通过划痕实验检测hCol对细胞迁移的影响。如图4d和4e所示,在hCol中hASC的迁移率相比天然牛胶原租和空白对照组更大。为了进一步测试这是否与胶原中的结构有关,对经过不同处理的hCol进行了细胞迁移研究。除了碱处理组外,所有处理组的迁移率都较无处理组降低(图4f),该结果显示了hCol种三股螺旋被破坏后将对细胞迁移造成影响, 侧面认证了hCol形成了影响细胞功能的三股螺旋结构。此外,为了分析hCol对细胞分化的影响,使用Oil Red O染色来显示细胞分化情况。在普通培养中hASCs没有脂肪生成,不显示Oil Red O阳性染色(图4g)。在脂肪诱导分化培养基(AIM)中培养的hASCs发生了分化,显示出阳性的Oil Red O染色。细胞种植在hCol包被表面上并处于在诱导培养基(AIM)中也发生分化,且检测到更多和更大的脂滴。 AIM+hCol组显示出较高百分比的脂质阳性细胞(图4h)。当hASCs分化为脂肪细胞时,激活了与分化相关的基因,包括脂蛋白酶(LPL)和过氧化物酶体增殖激活受体γ2(PPARγ2)。AIM+hCol组显示LPL的表达量相比与AIM组增加了2倍,PPARγ2的表达量增加了2倍(图4i和4j)。

     此外,hCol也表现出对皮肤的修复能力。与对照组相比,hCol组的小鼠伤口愈合速度更快(图5a)。图5b显示,在第7天,hCol组(n = 3)与对照组(n = 3)小鼠的伤口闭合值分别为79%与3%(P <0.05),在第14天为76%与56%(P <0.05),在第21天为55%与26%(P <0.01)。在伤口愈合的后期阶段,hCol显示表皮再生和无炎症的健康真皮,而对照组在第14天显示出再生的表皮中有炎症。在第21天,hCol显示出对照组么有的新生表皮的均匀厚度(图5c)。

图4.  hCol能促进hASC的细胞增殖、细胞迁移和脂肪生成

图5.  hCol具有促小鼠尾部皮肤伤口愈合的效果

     这项研究提供了一种量产天然胶原的策略,并提供了详细的证据来填补关于结构及其对细胞行为影响的知识空白,这些证据将支持hCol在组织修复中的应用。


文章的第一作者是博士后周辉,通讯作者是魏强研究员和肖锷博士。

论文详情请点击:https://academic.oup.com/rb/advance-article/doi/10.1093/rb/rbae008/7596629