题目：打破铁稳态：铁捕获纳米复合材料对抗细菌生物膜

期刊：Angewandte Chemie International Edition

影响因子：16.1

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202319690

汇报人：王雅洁-2023级硕士

鉴于新型抗生素的匮乏，根除细菌生物膜感染面临着巨大的挑战。细菌感染后，宿主会限制铁离子的摄入，而铁离子对细菌的生长和维持至关重要。细菌与宿主共同进化，发展出类似血红素摄取系统等适应性途径来避免铁缺乏。受此启发，作者提出了一种名为铁营养免疫疗法 (INIT) 的新策略，利用由镓、铜掺杂四(4-羧基苯基)卟啉 (TCPP) 金属有机骨架和聚胺-胺聚合物点构成的 Ga-CT@P 纳米复合材料，靶向细菌铁摄入并使其“饥饿”。由于铁/血红素与镓/TCPP 之间的相似性，镓掺杂的卟啉可以诱导细菌摄取镓离子，同时通过卟啉环从周围的细菌环境中提取铁离子。该策略为 Ga3+/Fe3+ 交换提供了一种“互利共赢”的方式。同时，聚合物点可以抑制细菌铁代谢，并作为实时荧光铁传感探针，持续监测动态铁限制状态。基于Ga-CT@P纳米复合材料的INIT诱导长期铁饥饿，从而影响铁硫簇的生物合成和碳水化合物代谢，最终促进生物膜的清除和组织再生。因此，本研究从营养学角度提出了一种创新的抗菌策略，为难治性细菌感染的治疗及其未来的临床应用提供了启示。

细菌感染目前被认为是最具挑战性的问题之一，也是临床感染性死亡的主要原因。细菌可以处于休眠状态，在生化上处于非活跃状态，但在某些营养丰富的环境中可以复活。传统的抗菌疗法主要依赖于抗生素，而抗生素无法跟上多重耐药病原体的出现。最终，抗生素耐药性的缺失会导致感染相关的死亡。因此，开发新的治疗方法来对抗伤口感染期间的致病生物膜至关重要。动态共价策略为利用不同构件生成材料提供了巨大的可能性。通常，这些构件通过可逆的动态共价键相互结合，实际上包含了各种可能的组合，并且由于成分的动态相互转化，可以构建热力学上稳定和适应性强的过程。动态共价策略已被应用于药物发现和递送等领域，应用范围从癌症治疗到细菌根除。从原理上讲，增加构件的价位可以产生更复杂的拓扑结构和功能。

微量金属是所有生命形式生存所必需的基本微量营养素。在细菌感染过程中，宿主的防御机制之一涉及对必需金属离子（特别是铁离子）的螯合，从而产生一种称为营养免疫的现象。病原体与宿主共同进化，并发展出适应性途径以避免铁缺乏，例如，通过具有高结合亲和力的特定铁螯合剂（称为铁载体）从宿主体内窃取铁。尽管宿主的铁缺乏环境，充足的铁载体和进化的铁吸收系统可以满足病原体对铁的需求。铁竞争发生在感染的各个阶段，宿主长期控制快速生长的病原体具有挑战性。因此，开发一种新的策略来应对铁捕获细菌的进化对于抗菌营养免疫疗法至关重要。

受这种营养免疫策略的启发，提出了一种“给予和索取”策略。这种方法包括同时从细胞外环境中去除Fe3+ 并引入假Fe3+ 来欺骗细菌摄取机制。这种开创性的铁营养免疫疗法 (INIT) 实现了双重铁营养免疫效果，有可能饿死病原体。镓 (Ga3+) 是一种半金属元素，其离子半径和化学特性都与Fe3+相似。微生物在区分 Ga3+ 和 Fe3+ 方面面临挑战。与 Fe3+ 不同，Ga3+ 在生理条件下不具有氧化还原活性，不能直接参与电子交换反应，因此表明在 INIT 中具有应用潜力。然而，由于 Ga3+ 的水解，单独使用 Ga3+，即使在高浓度下，也仅对一部分细菌菌株有效。因此，选择载体对作者的方法至关重要；因此，作者考虑了与血红素的结构相似性。血红素在体内的关键作用，特别是它能够将铁离子螯合到卟啉环中心的能力，促使作者探索能够模拟此功能的载体。在此背景下，四(4-羧基苯基)卟啉 (TCPP) 因其与血红素的结构相似性而成为有希望的候选物。TCPP 和血红素之间的结构相似性为它们具有可比的功能提供了理论基础，使 TCPP 成为合适的离子交换载体。

此外，TCPP 和血红素分子都共用一个卟啉环，该环由四个通过次甲基桥连接的吡咯亚基组成。血红素将Fe3+离子螯合到卟啉环中心，并在宿主细胞中发挥铁转运体的作用。鉴于TCPP与血红素高度相似，Ga3+掺杂的TCPP可以协同增强INIT，因为卟啉环上的空位与Fe3+的结合作用强于Ga3+。与细菌接触后，Ga3+掺杂的TCPP可以通过创新的结构框架有效释放Ga3+离子，同时将Fe3+离子从细菌环境中螯合。在这种情况下，“互利共赢”的策略可以协同诱导细菌铁饥饿直至死亡。此外，TCPP已被证明是制备光响应二维金属有机骨架（MOF）的有前景的模板，这些MOF表现出优异的光热和光动力学特性。因此，基于TCPP的二维MOF可以加速光触发离子释放，从而有望实现高效的Ga3+/Fe3+离子交换。

受这种营养免疫策略的启发，提出了一种“给予和索取”策略。这种方法包括同时从细胞外环境中去除Fe3+ 并引入假Fe3+ 来欺骗细菌摄取机制。这种开创性的铁营养免疫疗法 (INIT) 实现了双重铁营养免疫效果，有可能饿死病原体。镓 (Ga3+) 是一种半金属元素，其离子半径和化学特性都与Fe3+相似。微生物在区分 Ga3+ 和 Fe3+ 方面面临挑战。与 Fe3+ 不同，Ga3+ 在生理条件下不具有氧化还原活性，不能直接参与电子交换反应，因此表明在 INIT 中具有应用潜力。然而，由于 Ga3+ 的水解，单独使用 Ga3+，即使在高浓度下，也仅对一部分细菌菌株有效。因此，选择载体对作者的方法至关重要；因此，作者考虑了与血红素的结构相似性。血红素在体内的关键作用，特别是它能够将铁离子螯合到卟啉环中心的能力，促使作者探索能够模拟此功能的载体。在此背景下，四(4-羧基苯基)卟啉 (TCPP) 因其与血红素的结构相似性而成为有希望的候选物。TCPP 和血红素之间的结构相似性为它们具有可比的功能提供了理论基础，使 TCPP 成为合适的离子交换载体。

结果与方法：

1、Ga-CT和Ga-CT@P的合成与表征

图1.CT、Ga-CT和Ga-CT@P纳米复合材料的表征：a）Ga-CT@P的合成; B）Ga-CT的TEM图像; c）GaCT@ P的TEM图像; d）Ga-CT@P的HRTEM图像; e）制备的Ga-CT的AFM高度图像; f）Ga-CT@P的元素映射; g）Ga-CT、CT和Ga-CT@P的UV/维斯吸收光谱; h）Ga-CT的N1s XPS光谱; i）Cu-TCPP和Ga-TCPP的HOMO-LUMO能隙; j）TCPP、PAMAM PD和Ga-CT@P的傅里叶变换红外光谱（FTIR）光谱; k）CT、Ga-CT、PAMAM PD和Ga-CT@P的ζ电势;和l）PAMAM PD和Ga-CT @P的荧光发射光谱（插图：在UV光激发下的荧光成像。从左至右：1：PAMAM PD，2：PBS，3：Ga-CT@P）。(CT铜-三氯化磷，镓-三氯化磷：镓/铜-三氯化磷，镓-三氯化磷@P：镓/铜-三氯化磷@PAMAM PD）。

2、体外光热、光动力和发光活性

图2.光热、光动力学和Fe 3+敏感效应的评估：a）Ga-CT@P的光热和光动力学活性的示意图; B）多种纳米复合材料的红外热图像（500 μ g·mL-1），在808 nm激光照射下，测定了其在紫外-可见分光光度计上的吸收光谱在808 nm激光照射下，CT、Ga-CT和Ga-CT@P的光热加热曲线（4）在808 nm激光照射下，四次开关循环的光热循环曲线（1.0Wcm2）; e）CT、Ga-CT和GaCT@P相对于9的时间依赖性吸收光谱，10-蒽二基双（亚甲基）二丙二酸（ABDA）在660 nm激光照射下（1.0 Wcm ~ 2）的吸收光谱;（500 μgmL-1）在660 nm激光照射下与ABDA反应（1.0Wcm ~ 2）;（g）荧光强度曲线显示金属离子的选择性; h）在Fe 3+浓度为10 μM ~ 150 μM范围内，PAMAM PD检测Fe 3+的荧光强度曲线（小图显示了在紫外光激发下的荧光图像）：i）荧光强度与Fe 3+浓度之间的线性关系; j）Ga 3 + /Fe 3+交换策略（OMR：外膜受体）的示意图;和k）Ga 3+和Fe 3+结合的TCPP结构的静电势能。(CT：Cu-TCPP，Ga-CT：Ga/Cu-TCPP，和Ga-CT@P：Ga/Cu-TCPP@PAMAM PD）。

3、体外抗菌活性测定

图3.Ga-CT@P NC的抗生物被膜特性：a）E.coli和S.B）每毫升大肠杆菌CFU菌落数的相应统计数据。coli和S.金黄色葡萄球菌生物膜; c）金黄色葡萄球菌的细菌（活/死（Syto 9/PI）染色的代表性3D重建。aureus和E.大肠杆菌生物膜）; d）大肠杆菌生物膜的代表性SEM图像。coli和S.金黄色葡萄球菌生物膜; e）E.coli和S.（2）不同处理后的金黄色葡萄球菌在铬天青磺酸盐琼脂平板上的生物膜菌落数;coli和S.金黄色葡萄球菌生物膜; g）膜联蛋白V-FITC/PI;大肠杆菌生物被膜后与不同组孵育。(CT：Cu-TCPP，Ga-CT：Ga/Cu-TCPP，和Ga-CT@P：Ga/Cu-TCPP@PAMAM PD）。

4、Ga3+-肠杆菌素的密度泛函理论计算

图4.DFT计算结果总结：a）计算Fe 3 + -和Ga 3 + -肠杆菌素的键长、结合能和Eb/atom; B）计算Fe 3 + -和Ga 3 + -肠杆菌素的前线分子轨道能级图; c）Ga-CT@P纳米复合物的铁营养免疫机制示意图。

5、Ga-CT@P通过INIT靶向铁稳态

图5.E.a）DEGs分布的火山图（灰色：没有显著改变的基因;蓝色：下调的基因;和红色：上调的基因）; B）Ga-CT@ P处理的菌株组中DEG的网络分析; c）下调的和d）上调的DEG的GO富集分析; e）下调的和f）上调的基因的KEGG富集; g）与铁代谢相关的DEG的热图; h）与碳水化合物代谢相关的DEG的热图（红色：相对高表达的基因，蓝色：相对低表达的基因）; i）Ga-CT@ P诱导的铁营养免疫治疗的示意性机制。（Ga-CT@P：Ga/CuTCPP@PAMAM PD，OM：外膜，IM：内膜，和OMR：外膜受体）。

6、体内抗菌活性测定

图6.Ga-CT@P NCs消除体内伤口感染。a）体内抗菌研究程序; B）不同处理组中皮肤伤口和相对伤口愈合区域的肉眼照片; c）伤口大小随时间的代表性变化; d）E.琼脂平板上的大肠杆菌菌落; e）相应的统计学数据; f）代表性的H&E和Masson三色染色图像; g）相应的中性粒细胞百分比; h）相应的胶原沉积百分比; i）不同处理后IL-1β和Arg-1的代表性免疫荧光图像;以及j）IL-1β和k）Arg-1的百分比的相应定量数据。n=6。(CT：Cu-TCPP、Ga-CT：Ga/Cu-TCPP和GaCT@P：Ga/Cu-TCPP@PAMAM PD）。

结论：

在本研究中，作者成功合成了新型Ga-CT@P NCs，其菌落形成单位（CFU）减少了2个对数，可用于抗菌感染和生物膜形成。这些结果证实了Ga-CT@P NCs能够通过协同光热/光动力/铁营养免疫疗法成功对抗生物膜感染并靶向细菌铁营养代谢。首先，Ga-CT@P NCs利用带正电荷的PAMAM PDs在带负电荷的表面捕获细菌。它们具有显著的协同光热和光动力能力。其次，Ga3+掺杂的卟啉在光照下释放Ga3+离子，诱导细菌吸收Fe3+离子，同时通过卟啉环从周围的细菌环境中提取Fe3+离子。这种策略给细菌创造了一个缺铁环境，使其饿死，这被称为铁营养免疫疗法。同时，设计的Ga-CT@P纳米晶胞中的PAMAM光子晶体（PD）可作为监测器，监测细菌体内铁离子的动态限制。此外，研究人员还在转录组水平上研究了其抗菌机制。INIT策略有助于破坏铁硫簇代谢、TCA循环和ATP代谢。总而言之，Ga-CT@P所体现的INIT策略为未来通过破坏细菌营养稳态来治疗细菌感染提供了新的视角。