题目：仿生肽纳米网：利用细菌捕获巨噬细胞复活以对抗感染

期刊：ACS NANO

影响因子：15.8

原文链接：https://doi.10.1021/acsnano.4c03669

汇报人：孙梦欢-25级-硕士

为了提高基于肽的抗菌治疗的有效性，本研究提出了一种将细菌捕获肽与免疫调节肽相结合的分子设计策略。这种双重方法旨在选择性地增强免疫系统，刺激对细菌的趋化性和吞噬作用。本研究的目的是建立一个基于人类防御素6肽的升级多维整合抗菌体系。该系统具有广泛交联的纳米纤维，提供捕获和适度杀死细菌的双重功能，以及激活免疫吞噬细胞，刺激吞噬细胞趋化性和增强细菌吞噬作用的能力。

全球抗微生物药物耐药性的惊人上升凸显了对有效抗菌药物的迫切需求。抗生素耐药性（AMR）每年造成的死亡人数超过艾滋病毒/艾滋病或疟疾，预计到2050年总经济成本高达100万亿美元。发现有效的抗菌剂可能是解决细菌耐药性挑战的潜在途径。幸运的是，在先天免疫系统中，管腔中的人类防御素6（HD 6）经历自组装成纳米网以捕获病原体。这一过程显著减少了病原体对肠粘膜细胞的侵袭，将HD 6与具有广谱抗菌活性的一般人防御素区分开来。在先天免疫系统中，当HD 6将细菌病原体捕获在管腔中时，各种宿主防御因子，包括某些抗菌剂和招募的吞噬细胞，共同抑制细菌病原体。多种防御因子协同工作以构建肠道防御系统。

先前的研究主要集中在HD 6模拟肽仅针对细菌的捕获功能上，而忽略了它们在宿主免疫系统内的相互作用。为了提高基于肽的抗菌治疗的有效性，本研究提出了一种将细菌捕获肽与免疫调节肽相结合的分子设计策略。这种双重方法旨在选择性地增强免疫系统，刺激对细菌的趋化性和吞噬作用。本研究的目的是建立一个基于HD 6肽的升级多维整合抗菌体系。该系统具有广泛交联的纳米纤维，提供捕获和适度杀死细菌的双重功能，以及激活免疫吞噬细胞，刺激吞噬细胞趋化性和增强细菌吞噬作用的能力。

1.

抗菌系统包括两个关键功能域：

（i）利用肽自组装原理，通过交替亲水-疏水性残基构建纳米纤维网络。随后，极性不带电荷的残基被策略性地定位在带电荷的残基之间以进行电荷分离，这促进了在生理条件下稳健的纤维形成。

（ii）将来自人乳铁蛋白（hLF）的18环区域（RKVRGPP）的六个残基序列引入基于肽的抗微生物系统的C-末端区域。这种修饰用于改善免疫细胞迁移和吞噬作用，同时减轻不期望的炎症，最终加强宿主对细菌感染的防御。

（iii）从传统抗微生物肽（AMP）的结构见解中得出，这两个区域与GSGS连接以创建可能产生意想不到的抗菌特性的整体系统。RFQF4表现出出色的细菌捕获能力以及适度的抗菌活性。转录组学分析表明，RFQF4促进能量耗散，膜相关成分的生物合成，并限制鞭毛运动。详细的体内评估表明，纳米网形成肽表现出显著的抗微生物功效，同时没有显示出全身毒性的迹象。在此，捕获和杀死细菌的同时诱导，沿着免疫调节，无疑提高了细菌感染治疗的效率。

2.

大多数肽显示出针对大肠杆菌的超过80%的综合细菌凝集效率。值得注意的是，RFQF4表现出最高的综合细菌凝集效率，超过90%，并表现出时间和浓度依赖性关系。RFQF4不仅截留和凝集细菌，而且通过降低被捕获细菌的存活率而表现出潜在的杀菌特性。

3.

分析了RFQF4的结构，在10μM的浓度下，RFQF4显示ANS荧光强度的显著增加，表明从单体到组装结构的转变。用透射电子显微镜观察了在两倍CAC浓度下RFQF4聚集体呈现出由短而薄的纳米纤维组成的广泛的纤维状结构，扫描电子显微镜图像也一致地显示了多肽的均质纳米纤维结构，观察到RFQF4的纳米纤维密度相对较高。圆二色性光谱验证了RFQF4的自发自组装，揭示了意想不到的α-螺旋结构倾向。通过XPS和FTIR分析RFQF4的化学键合状态。XPS结果证实RFQF4形成共价交联和氢键相互作用的多重网络。FTIR也证实了氢键存在。这些发现表明RFQF4的纳米纤丝结构是通过氢键和π−π相互作用构建。Zeta电位结果显示，肽上带有大量的正表面电荷，这有助于其利用细菌表面大量的负电荷结合和截留细菌。

4.

使用RNA测序技术来剖析RFQF4的潜在机制信息。值得注意的是，RFQF4处理增加了火山图中656个基因的表达，降低了602个基因的表达。KEGG分析显示，与代谢、遗传信息处理、细胞过程和环境信息处理等关键生物学过程相关的20个KEGG途径中有358个DEGS富含。重要的是，双组分信号传导系统(TCS)有助于调节细菌的各种生理过程，并与新陈代谢和毒力密切相关。除少数下游基因受代谢调控外，大多数由TCS调控的致病相关基因表达下调。肠上皮细胞的有效黏附和侵袭需要鞭毛或鞭毛的运动，这一过程在大肠杆菌中由大约50个基因调控。在RFQF4处理后，参与调节鞭毛依赖的细胞运动的关键基因的表达显著减少。这种对细胞运动的影响很好地解释了RFQF4捕获细菌和抑制细菌入侵的机制。

5.

将RFQF4纳米纤维注射到小鼠体内来评估其体内生物安全性。生化评估肝毒性包括测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)和谷草转氨酶(AST)，并用血清肌酐(CRAE)和血尿素氮(BUN)评估肾毒性。未观察到这五个参数的升高，以确保体内平衡和正常生理状态。由于肝、肾损伤对药物在体内有明显的屏障作用，故对肝、肾进行了组织病理学检查。与对照组相比，用不同浓度的RFQF4纳米纤维处理的肝脏和肾脏都没有出现病理变化，注射组的器官指数(肝、脾、肺和肾)与对照组没有显著差异。这些结果表明，RFQF4纳米纤维具有显著的生物相容性和潜在的应用前景。接下来，腹膜炎-脓毒症的小鼠模型进一步探索了RFQF4的治疗功效。染色结果显示脓毒症组受检器官病变明显。相比之下，RFQF4治疗组显示出这些症状的可观察到的减少或甚至不存在。RFQF4治疗组具有相对正常的器官结构。总的来说，全身性细菌感染中细菌负荷的降低和器官病变的减轻表明RFQF4在治疗败血症和细菌感染方面具有巨大潜力。

从人类防御素6的细菌捕获机制中汲取灵感，我们制造了由多个功能片段组成的仿生肽纳米网，用于根除细菌。这些仿生肽纳米网旨在通过双重方法策略解决抗生素耐药性挑战。首先，由此产生的纳米纤维网络捕获细菌，随后通过松动膜结构、消散质子动力并引起多种代谢扰动来杀死它们。其次，这些被困的细菌簇通过PI3K-AKT信号通路和ECM受体相互作用，通过增强的趋化性和吞噬作用重新激活巨噬细胞以清除细菌。体内结果证明，用仿生肽纳米网治疗可以减轻全身性细菌感染，而不会引起明显的全身毒性。正如预期的那样，拟议的策略可以通过捕获细菌和唤醒抗菌免疫反应来解决顽固感染。这种方法可以作为未来临床应用生物启发材料设计的指南。