Weekly Seminar
题目：TPGS-based and S-thanatin functionalized nanorods for overcoming drug resistance in Klebsiella pneumonia
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-31500-3
汇报人：康怡 2020级硕士
替加环素被认为是对抗耐多药克雷伯氏肺炎菌的最后一道防线。然而，药物利用率的提高导致了耐药性和治疗失败率的上升。在这里，作者设计了一个 D-α 生育聚乙二醇琥珀酸修饰的纳米棒和基于磷酸钙纳米颗粒的S-thanatin肽功能化纳米棒，用于替加环素递送和由替加环素耐药克雷伯氏肺炎菌引起的肺炎治疗。与细菌共孵育后，所制备的纳米棒可通过抑制丁二酸生育酚聚乙二醇的外排泵作用，以及S-thanatin对细菌的靶向作用，增强替加环素在细菌体内的积累。二者的协同抗菌能力进一步增强纳米棒的抗菌活性，从而克服克雷伯氏肺炎菌对替加环素的抗药性。静脉注射后，纳米棒可显著降低白细胞和中性粒细胞计数，减少细菌菌落，改善中性粒细胞浸润事件，从而大大提高肺炎小鼠的存活率。这些发现可能为耐药细菌引起的感染提供一种治疗策略。
肺炎克雷伯菌（KPN）被认为是威胁公共卫生的最严重的医院病原体之一。作为一种革兰氏阴性菌，KPN 可在免疫系统不足的住院患者中诱发多种感染，如肺炎、肝脓肿、尿路感染、脑膜炎和菌血症。近年来，具有高毒力和粘液表型的 KPN 菌株逐渐成为临床上可引起健康人群严重感染并严重威胁其健康的重要病原体。最近，纳米药物递送系统 (DDS) 已成为致命感染的新治疗手段。 DDS 可以增加药物在血液中的保留时间，减少非特异性分布，并在感染部位靶向递送药物。纳米材料和抗生素的联合治疗可能有助于提高治疗指数。然而，随着碳青霉烯类抗生素在临床治疗中的广泛应用，碳青霉烯类耐药 KPN (CRKP)明显增加，并成为一个严重的公共卫生问题。替加环素(TIG)通常被认为是对抗 CRKP 的最后防线之一。许多研究已经构建了基于 Ag、Au、Cu、Fe、Ti 和介孔二氧化硅纳米粒子的DDS 来治疗传染病，但它们在体内的临床应用受到安全性的阻碍。更有效的基于纳米材料的递送策略，例如 pH 触发、酶敏感和细菌毒素触发的 DDS，可能会允许以时空控制的方式释放抗生素，并在全球范围内引起关注。然而，这个过程复杂而精密，释放的抗生素对细菌缺乏特异性。因此，针对细菌具有靶向功效的安全DDS可能是治疗TRKP引起的感染的有效策略。
图1 TTCT的制备和表征
通过将纳米棒的 X 射线衍射 (XRD) 光谱与羟基磷灰石晶体的典型晶体衍射峰进行比较，证实了纳米棒的晶体结构和化学成分（图1A）。之后，TIG 通过透析方法被封装到 Ts-TPGS/Cap 和 TPGS/Cap 纳米棒中。材料粒度保持在~25nm并显示出窄的粒度分布（图1B）。所有配方都表现出带负电荷的单峰 zeta 电位分布（图 1C）。然而，在 Ts 修饰后，纳米棒的 zeta 电位从 -18.56 ± 1.66 mV 降低到 -14.99 ± 1.66 mV，可能是因为 TPGS 的一些羟基被 Ts 取代。此外，TIG 负载进一步降低了 zeta 电位，这可能是由于药物和纳米棒之间的静电相互作用。透射电子显微镜 (TEM) 图像显示所有制剂均具有均匀的棒状形态（图 1D）。通过动态光散射研究了作为时间函数的制剂的稳定性。观察到制备的纳米棒在储存 20 天后是稳定的，粒径和 PDI 变化很小（图1E，F）。此外，在含有 10% 胎牛血清 (FBS) 的 PBS 中，TCT和TTCT的粒径和 PDI 在 24 小时内几乎保持不变（如图 1G 所示），表明 TCT 和 TTCT 在循环中不会分解。
图2 TTCT 对 KPN 和 TRKP 的体外抗菌活性评价
如图2A所示，TIG对KPN和TRKP的最小抑制浓度（MIC）分别为1 μg/mL和4 μg/mL，表明TRKP对TIG不敏感。TTCT的抗菌能力最好，MIC值最低。对于TRKP，TIG和TCT的MIC值分别为4 μg/mL和2 μg/mL，表明基于TPGS的纳米药物递送系统可以改善TRKP的TIG耐药性。值得一提的是，TTCT的MIC值为1 μg/mL，与游离TIG对KPN的MIC值相当，提示TTCT对克服耐药性有效。TIG、TCT和Ts-TPS/Cap不能阻止细菌的生长（图2B, C）,结果与图2A所示的一致。总体而言，TTCT 在 KPN 和 TRKP 中均表现出比 TIG 和 TCT 更好的抗菌活性。如图2D所示，与含TIG的制剂孵育后，细菌的放大SEM 图像显示出显着的形态变化，例如细胞膜破裂、碎片和细胞完整性丧失。TTCT在KPN和TRKP组中都大量破坏了细菌结构，进一步证实了TTCT的优越抗菌效果。总之，图4所示的所有结果表明，与TIG、TCT和Ts-TPGS/Cap纳米棒相比，TTCT是一种优异的制剂，对KPN和TRKP均具有出色的抗菌功能。
图3: TTCT 克服耐药机制的研究
如图 3A 所示，NT-TPGS/Cap 和 Ts-TPGS/Cap 纳米棒均随着孵育时间延长，细菌内荧光信号逐渐增加。在KPN和TRKP中，Ts-TPGS/Cap纳米棒在2小时和6小时都表现出比NT-TPGS/Cap 纳米棒更强的细菌内化能力。结果与流式细胞仪获得的结果一致（图3B，C）。在与Ts-TPGS/Cap纳米棒孵育后，KPN中的荧光信号在2 h和6 h时比NT-TPGS/Cap纳米棒的荧光信号高约2倍（图3D）。对于 TRKP，观察到类似的结果，表明 Ts-TPGS/Cap 纳米棒表现出更好的细菌内化活性，这可能归因于靶向部分Ts肽。
图4 Ts-TPGS/Cap 体内生物分布及靶向性评价
通过将 KPN或TRKP细菌气管注射到健康小鼠的肺部创建急性肺炎小鼠模型并研究了 Ts-TPGS/Cap纳米棒的体内靶向效率。如图4A, B所示，Ts-TPGS/Cap 纳米棒在感染 KPN 和 TRKP 的肺炎小鼠之间表现出相似的生物分布特征。此外，用Ts-TPGS/Cap纳米棒处理的肺中的荧光信号比用TPGS/Cap处理的肺中的荧光信号强得多，这意味着更多的Ts-TPGS/Cap纳米棒在受感染的肺中积累（图 4A，B）。在由 KPN 和 TRKP 引起的肺炎小鼠中，肺中Ts-TPGS/Cap纳米棒的荧光定量信号（以每克组织的荧光强度，ID/g 表示）分别比TPGS/Cap在5 h和 24 h高出1.5倍和约2.5倍（图4C，D）。Ts-TPGS/Cap纳米棒在24小时主要分布在肺炎小鼠的gan zang、fei和shen zang中。肺的ID/g高gan zang和shen zang。
图5 TTCT 体内抗感染效果的研究
如图5A、B所示，感染TRKP的肺炎小鼠在5天时存活率为33.3%，而感染 KPN 的小鼠为16.7%。获得抗性后，细菌的毒性可能会降低。接受TIG和TCT治疗（TIG剂量：15 mg/kg）的KPN感染小鼠的存活率分别为66.7%和83.3%，这表明将TIG包裹在纳米棒中提高了其抗菌活性。此外，Ts-TPGS/Cap纳米棒处理还提高了 KPN 感染小鼠的存活率。细菌感染导致白细胞和中性粒细胞明显增加（图5C-D）。如图5E 所示，在KPN和TRKP感染的小鼠中，BALF中的总细胞过度增加。当受感染的小鼠接受含TIG的制剂和Ts-TPGS/Cap纳米棒时，总细胞表现出显着减少，而 TTCT 在这些组中表现出最高的减少。图5F观察到中性粒细胞分别占KPN感染和TRKP感染小鼠总细胞的约85%和75%。施用 TIG、TCT、TTCT 和 Ts-TPGS/Cap纳米棒后，中性粒细胞百分比明显降低。如图5H所示，在KPN和TRKP感染的小鼠中CRP水平显着升高。TTCT纳米棒处理后其水平明显降低。总体而言，TTCT 治疗始终显示出最佳治疗效果，血液中 WBC 和中性粒细胞计数较低，肺中性粒细胞浸润较低，CRP水平和细菌菌落降低较多。这些结果可能是由Ts肽的抗菌活性和外排pu的抑制作用。
总之，基于TPGS和Ts修饰的具有LPS靶向和协同抗菌活性的纳米药物递送系统被设计用于TIG递送和治疗由MDR细菌引起的急性肺炎。制备的 Ts-TPGS/Cap 纳米棒可以有效包裹TIG并实现药物缓释。通过Ts和LPS之间的结合，Ts-TPGS/Cap在KPN和TRKP中都表现出靶向和增强的积累。TPGS对TRKP中外排泵活性及acrA、acrB和ramA的表达具有抑制作用。这样，TTCT组细菌内的TIG浓度显着高于TIG和TTCT组。 Ts与TIG的协同抗菌能力进一步增强了TTCT的抗菌活性，从而克服了TRKP的耐药性。
在患有肺炎的小鼠中， TTCT给药可显着降低血液样本中的WBC和中性粒细胞计数，并降低 BALF 中的总细胞和 CRP 水平。此外，TTCT能够改善肺部中性粒细胞浸润，减少BALF细菌菌落，从而明显提高KPN和TRKP引起的肺炎小鼠的存活率。此外，TTCT对肝*几乎没有毒性。这些结果表明TTCT可以克服TRKP的耐药性。