题目：具有双谷胱甘肽耗竭特性的类过氧化物酶活性的纳米药物增强奥沙利铂的化学敏感性并促进程序性细胞死亡
期刊：《ACS Nano》
IF：18.027
原文链接： https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.1c06777
汇报人：孙浩2020级硕士
本研究采用枝状介孔二氧化硅纳米颗粒(DMSNs)作为纳米载体，将超小的Fe3O4纳米颗粒、Mn离子和谷氨酰胺酶抑制剂(CB-839)整合到DMSNs的孔中，形成DMSN/Fe3O4-Mn@CB-839 (DFMC)纳米药物。这种纳米药物在酸性条件下表现出类过氧化物酶的活性，催化H2O2分解为羟基自由基(·OH)，也促进了细胞发生铁死亡所需的脂质过氧化物的形成。此外，这种纳米药物可以消耗肿瘤微环境中的GSH，从而增强活性氧(ROS)介导的肿瘤催化治疗。引入的CB-839阻断了内源性GSH的合成，进一步增强了GSH的耗竭性能，从而减少了奥沙利铂（GSH相关耐药）从肿瘤细胞中的排泄，并恢复了奥沙利铂的化学敏感性。纳米药物DMSN/Fe3O4-Mn@CB-839基于GSH的双重耗竭性削弱了GSH相关的ADS，增强了奥沙利铂的化学敏感性，诱导肿瘤细胞凋亡和铁死亡。开发基于集成纳米技术和临床药物的纳米医学有助于肿瘤治疗的发展。
恶性肿瘤是严重危害人类健康的主要疾病之一，是世界范围内的主要死亡原因之一。近几十年来，肿瘤诊断和治疗方法经历了里程碑式的发展，从化疗到肿瘤靶向治疗和纳米医学。由于Fe3O4纳米粒子具有类似过氧化物酶(POD)的活性，具有生物酶催化活性的纳米材料(简称纳米酶)因其良好的生物相容性和稳定性而被广泛研究，并且可用于肿瘤治疗。纳米酶仅在肿瘤特异性的酸性环境中催化H2O2分解产生毒性·OH，诱导肿瘤细胞凋亡和避免正常组织损伤。因此，具有POD样活性的纳米酶在抗肿瘤治疗中具有重要的应用潜力。然而，为了平衡过量ROS的积累，肿瘤细胞会产生更多的抗氧化剂(如GSH)来维持肿瘤微环境(TME)中的氧化还原稳态,这种与GSH相关的抗氧化防御系统限制了纳米酶的催化作用，使其无法达到预期的抗肿瘤治疗效果。因此，有必要通过探索促进GSH耗竭的策略来调控TME，以实现更有效的肿瘤催化治疗。
具有双重GSH耗竭特性和类POD活性的DMSN/Fe3O4-Mn@CB-839纳米药物的合成过程示意图，用于协同抗肿瘤治疗
1．DFM的合成与表征
图1. DFM的合成及组成表征。DMSN NPs (a)、DMSN/ Fe3O4 NPs (b)和DFM NPs (c)的透射电子显微镜图像。(d) DFM的STEM映像和相应的区域元素映射。(e) DFM NPs的XPS光谱。(f) DFM NPs的高分辨Fe 2p谱。(g) DFM NPs的高分辨Mn 2p谱。
合成的DMSNs透射电子显微镜(TEM)图像显示为均匀的球形形貌，表面显示为中心放射状树枝状纳米结构，平均直径约为160 nm(图1a)。高角度环形暗场成像-扫描TEM图像清晰显示了DFM NPs的树枝状多孔结构(图1d)。上述结果充分证明了DFM NPs的成功合成，并且表现出良好的分散性。此外， XPS进一步证明了DMSN-Fe3O4–Mn NPs的元素组成(Mn、Fe、Si和O元素)以及混合价态的存在(图1e)。这些实验结果表明，DFM NPs是成功合成的，具有良好的分散性和稳定性。
2. DFM催化性能和药物负载性能
图2. DFM的体外催化性能及载药性能。(a) DFM去GSH催化过程示意图。(b)不同处理的DFM Mn元素累积浓度(100 μg/mL)。(c)在pH 6.5下用DFM (100 μg/mL)处理后的GSH消耗。(d) DFM类POD活性催化过程示意图。(e)不同处理下oxTMB的紫外-可见吸收光谱变化。该插图是对应处理的照片。(f) 不同H2O2浓度下oxTMB的紫外-可见吸收光谱变化。该插图是对应处理的照片。(g) DFM(100 μg/mL)在pH 6.5 (H2O2设定为对照)下的ESR谱。(h) 替格列奈司他(CB-839)吸收的浓度相关标准曲线。(I) DFMC CB-839在不同处理(n = 3)下的释放曲线(100 μg/mL)。NS：不显著；*：P < 0.05**，P < 0.01***，P < 0.001。
如图2e所示，在TMB和H2O2 (pH 6.5)的混合溶液中加入DFM NPs后，混合溶液的颜色变为蓝色，并通过紫外-可见吸收光谱观察到两个明显的吸收峰，验证了DFM表现出固有的POD-样活性。由5，5-二甲基-1-吡咯啉N-氧化物生成的·OH的电子自旋共振光谱也证实了DFM能有效催化H2O2(图2g)。为评价DFM NPs的载药性能，对其载药量(LC)和包封效率(EE)进行了测试。如图2h所示，游离CB-839在270 nm波长下的吸光度与药物浓度呈线性关系。
3. DFMC诱导铁死亡的机制
图3. DFMC 诱导铁死亡的机制。(a)用 DFMC NPs孵育的CT26细胞的生物 TEM 图像（红色箭头表示内吞DFMC NPs；比例尺 = 200 nm）。（b）不同处理后用 DCFH-DA 染色的 CT26 细胞的共聚焦图像（比例尺 = 20 μm）。(c) 用 DFMC (n = 3) 处理的CT26细胞和肿瘤组织中 GSH 的减少。（d）不同处理后CT26细胞中GPX4表达水平的Western印迹结果。 (e) 用 DFMC 孵育的 CT26 细胞的 LPO 水平。 (f) ferroptosis 抑制剂 (ferrostain-1) 对 DFMC 细胞毒性的影响。 (g) CT26 细胞微形态变化的生物TEM图像（红色、蓝色和绿色箭头分别表示线粒体、细胞核和凋亡小体；比例尺分别 = 1 μm 和 200 nm）。 NS：不显著；*：P < 0.05**，P < 0.01***，P < 0.001。
如图3a所示，生物学TEM观察显示，DFMC NPs可通过细胞膜进入细胞质，说明其是通过内吞作用被吸收的。与仅使用CB-839或DFM的治疗相比，在DFMC治疗后，检测到CT26结肠癌细胞和肿瘤组织中GSH显著减少(图3c)。图3d显示，DFMC治疗后，CT26细胞中的GPX4表达显著降低。DFMC处理后的CT26细胞超微结构特征出现明显的核固缩和凋亡小体，同时观察到线粒体收缩，分别为细胞凋亡和铁下垂的特征(图3g)。这些结果表明，在用DFMC处理的CT26细胞中发生了两种不同类型的程序性细胞死亡，即铁死亡和凋亡。
4. DFMC诱导的细胞凋亡和铁质的体外评估
图4. DFMC 诱导的细胞凋亡和铁死亡的体外评估。(a)不同处理后 CT26 细胞中 Bax、Bcl-2 和裂解的的半胱天冬酶 3 表达水平的蛋白质印迹结果。用不同样品处理后 CT26 细胞中 Bax(b) 和 Bcl-2(c) 的相对表达水平。(d) DFMC 在 pH 6.5 下孵育 24 小时后 3T3 成纤维细胞的细胞活力。（e）不同处理后CT26细胞的细胞毒性谱。(f) 凋亡抑制剂 (Ac-DEVD-CHO)对DFMC细胞毒性的影响。(g)在 DFMC 等效浓度(300 μg/mL; 比例尺 = 100 μm) 下不同处理后用 calcein-AM/PI 染色的 CT26 细胞的共聚焦图像。 (h) 流式细胞仪对不同处理后 CT26 细胞的凋亡分析。 NS：不显著；*：P < 0.05**，P < 0.01***，P < 0.001。
从图 4a-c分析表明，DFMC纳米药物具有类似POD的活性，并具有双重GSH消耗特性，可有效促进细胞凋亡和铁死亡，并恢复奥沙利铂的化学敏感性。DFMC NPs 在不同浓度下对正常细胞增殖的影响可以忽略不计（图 4d）。如图 4e 所示，当用 DFMC 或 DFMC + 奥沙利铂处理时，细胞增殖能力以剂量依赖性方式明显降低。如图 4f 所示，Ac-DEVDCHO（凋亡抑制剂）显着抑制 DFMC 引发的细胞活力降低。这些结果证明了双重GSH消耗特性有效地增强了DFMC纳米药物的高协同抗肿瘤作用。
5. DFMC的成像性能
图5. DFMC 的生物分布和 T1/T2 加权 MRI 性能。 (a) CT26 肿瘤小鼠在注射 DFMC-Cy5.5 NPs 后不同时间的体内荧光成像。(b) 小鼠在不同时间的相对荧光强度。(c) 48 小时主要器官和肿瘤的离体荧光成像。静脉注射DFMC NPs后不同时间Fe（d）和Mn（e）在主要组织和肿瘤中的生物分布（每克组织注射的Fe和Mn剂量（ID）的百分比；n = 3）。 （f）静脉内给予 DFMC 不同时间（0、1、3、6、12 和 24 小时；红色箭头指向环形强化）后肿瘤部位的体内 T1/T2 加权 MRI 信号强度。 (g) 通过计算不同时间注入尾静脉的 DFMC 的 CER 值 (n = 3) 定量分析肿瘤成像性能。
如图5a所示，可以观察到肿瘤区域出现的荧光强度在6小时达到平台期，表明DFMC NPs可以迅速在肿瘤中积累。荧光成像特征证明了 DFMC NPs 具有高肿瘤积累的能力，并且可以从正常器官中排出（图 5c）。T1/T2 MRI 结果表明，注射后 6 h 肿瘤部位的信号强度明显变亮和变暗（红色箭头指向图 5f 中的环形加强）。此外，肿瘤区域 MRI 信号强度的定量 CER 分析进一步证实了这些结果（图 5g）。因此，DFMC纳米药物可作为一种很有前景的MRI造影剂应用于肿瘤诊断和监测肿瘤治疗。
6. DFMC的体内协同抗肿瘤治疗
图6. DFMC 的体内协同抗肿瘤治疗。(a) CT26 肿瘤异种移植物的产生和抗癌治疗程序的示意图。 不同治疗（n = 5）小鼠的相对肿瘤体积（b）和平均肿瘤重量（c）的变化。（d）各种治疗的小鼠相对体重的变化（n = 5）。(e) 治疗结束时（第 14 天）各组 CT26肿瘤小鼠的代表性照片。(f) 治疗结束时（第14天）每组分离出的肿瘤的数码照片。（g，h）不同组 CT26 荷瘤小鼠肿瘤切片的 HE 染色和 TUNEL 染色（比例尺分别为 50 μm 和 40 μm）。 NS：不显著；*：P < 0.05**，P < 0.01***，P < 0.001。
DFMC 纳米药物在治疗 14 天后显着阻止了肿瘤的生长（图 6b）。DFMC纳米药物治疗组小鼠的体重在治疗期间没有明显下降，说明使用 DFMC NPs 时具有良好的生物安全性（图 6d）。此外，来自不同治疗组的肿瘤小鼠和切除肿瘤的视觉照片证实了DFMC纳米药物取得了显着的治疗效果（图6e，f）。如图6g所示，与生理盐水组相比，从DFMC组小鼠采集的肿瘤组织表现出严重的组织学损伤，而从CB-839和DFM组小鼠采集的肿瘤切片表现出中度组织损伤。此外，TUNEL染色试验显示与上述H&E染色结果一致的趋势，进一步证明了DFMC纳米药物的显着抗肿瘤作用（图6h）。
综上所述，本研究报道了一种既具有纳米催化剂性质又具有谷氨酰胺酶抑制剂性质的纳米药物(DFMC)，该药物具有类POD活性的双GSH耗竭特性，可促进细胞凋亡和铁死亡的协同治疗，并增强奥沙利铂的化疗敏感性。DFMC既消耗肿瘤微环境现有的GSH，又阻断GSH的合成，削弱了GSH相关的ADS，从而增强了ROS介导的肿瘤催化治疗，提高了奥沙利铂的化疗敏感性，进而达到较高的肿瘤清除率。此外，DFMC中的Mn和超顺磁Fe3O4纳米粒子可以在体内实现MRI的T1/T2加权。通过本研究引入纳米药物，为抗肿瘤治疗提供了思路，有望对未来纳米药物的发展具有良好的意义。