题目：纳米抗体功能化纳米粒子--加速病毒抗原快速简易检测的发展

期刊：《Biosensors and Bioelectronics》

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.113971

汇报人：魏娟 2020级硕士

加速开发快速、负担得起且易于获得的检测方法可以有效控制新出现的传染病。本文介绍了一种溶液内检测管道的设计，其特点是采用纳米抗体功能化的纳米颗粒用于快速电子检测埃博拉病毒和COVID-19抗原（Nano2RED）。其中，具有高亲和力、特异性和稳定性的合成纳米抗体对选自组合文库并与金纳米粒子(AuNP)进行位点特异性结合。无需任何荧光标记、洗涤或酶促扩增，这些多价AuNP传感器在混合到物理AuNP聚集和沉降过程时可靠地转递抗原结合信号，显示出抗原依赖的光学消光，易于通过光谱法或便携式电子电路检测。Nano2RED以埃博拉病毒分泌的糖蛋白(sGP)和SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域(RBD)为靶标，显示出高灵敏度（sGP的检测限为∼10 pg /mL，0.13 pM；RBD检出限为∼ 40 pg/mL，1.3 pM），高特异性、大动态范围（~7 log）和数分钟内的快速读数。快速检测、低材料成本（估计每次测试 < 0.01 美元）、廉价和便携式读出系统（估计 < 5 美元）和数字数据输出，使Nano2RED成为筛选患者样本以成功控制传染病的特别方便的检测方法。

近年来，病毒性传染病多次出现，为了应对未来可能出现的传染性高，致命性强的病毒传染病，有必要加快诊断流程的设计、开发和验证。

目前的诊断方法依赖于基因(或分子)、抗原或血清学(抗体)标记的检测。基因诊断使用DNA测序、聚合酶扩增分析或最近的CRISPR技术。例如，实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测因灵敏度高被视为金标准。然而，这些测试也非常昂贵、耗时，而且需要大量的仪器。基因检测也经常通过从非活性病毒中提取基因片段而显示假阳性。相比之下，抗原和抗体检测允许更快速、负担得起和可获得的检测，而不需要复杂的样品制备或扩增。因此，这些检测方法适合于监测和及时隔离高传染性个体，特别是在临床环境之外。虽然抗体(如IgM)检测已用于疾病诊断，但其预测性较低，更适合于免疫反应研究。相比之下，病毒蛋白抗原检测为诊断症状患者提供了可靠的现场测试解决方案。此外，由于抗原检测快速、易于操作和低成本，可以高频、大量部署用于实时监测，这被认为是破坏病毒传播链的一个至关重要的因素。

目前抗原诊断通常采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和侧流免疫试验(LFIs)。ELISA是分析抗原和抗体的主要工具，但它步骤繁琐，洗涤步骤多，在读数前需要数小时的孵化期，以及一个依赖于底物转换和发光记录的读出系统。在高通量大规模筛选中部署ELISA需要自动化的液体处理系统来协调复杂的工作流程，这对于便携应用来说并不理想。LFIs可能更容易在实验室外部环境下使用，但与ELISA相比，其灵敏度通常较低，因此准确性较差。因此建立一种检测快速、易于操作、低成本和可高频大量部署于现场检测的病毒抗原检测方法很有必要。

1.     纳米抗体共结合对的选择和AuNP功能化

图1. Nano2RED分析方法的建立与表征示意图

图2. 抗原特异性纳米结合物的鉴定和表征

作者通过组合纳米抗体库的噬菌体展示选择、细菌表达、共结合剂验证和AuNP功能化，生成针对目标抗原的纳米抗体共结合对(图1a)。作者评估了不同生物筛选轮富集的候选纳米抗体的克隆多样性和共结合能力(图2a)。两个最优共结合剂对，称为sGP7 sGP49和RBD8 RBD10，被细菌表达和纯化(图2b)。通过BLI(图2c)测量了它们的平衡解离常数(KD)，并通过ELISA(图2d)和BLI(图2e)验证了它们的共结合活性。最后，纳米抗体被大肠杆菌生物素连接酶(BirA)生物素化，然后装载到链霉亲和素涂层的AuNPs上。

此实验设计中，密集包覆生物素化纳米抗体的AuNPs可实现多价抗原感应(图1a和b)，与单价结合相比，能显著增强抗原结合。此外，多价结合也促进了AuNP聚集和随后的沉淀，在几分钟内产生抗原浓度依赖的信号。传感原理为AuNPs在没有非特异性粒子-粒子相互作用的情况下，最初均匀地分散在胶体中，呈现出局部表面等离子体共振(LSPR)消光的红色。在与病毒抗原混合后，多个AuNPs被抗原-纳米抗体结合在一起，逐渐形成聚集体，AuNP聚集体的形成会逐渐扩大LSPR消光，并在重力超过流体阻力时形成球团(图1c-d)。这导致了AuNP胶体的透明度增加，然后可以在孔板上用分光光度计或简单的电子设备进一步量化颜色变化。

2.     sGPS的比色与光谱传感

作者首先优化了的直径，最终选择80 nm，首先使用单抗体sGP49功能化的AuNP检测sGPS，结果如图3，最终可以检测10 pM到100 nM的sGP，检测限为15 pM (1.25 ng/mL)，这支持从患者血液中进行临床相关的埃博拉检测。且10 nM的sGP在20 – 70℃的较宽温度范围内很容易与质控样品区分开来(图3h)。这表明该检测方法在环境温度下是稳定的。

图3. 利用单结合抗体sGP49孵育检测埃博拉病毒sGP

3.     快速sGP检测与便携式电子读出设备(Nano2RED)

3 h孵育可有效地实现AuNP的连接和沉淀，且短于ELISA，远优于许多RT- PCR检测。然而，快速诊断即小于30分钟，是更有优势的。因此，作者进一步研究了速率限制传感机制，以减少检测时间。使用10 nM的sGP作为抗原，作者发现，在涡旋混合后，颜色对比度足够高，肉眼可以立即分辨，需要最少的孵育(图4h)。包括样品采集、移液、离心、涡旋混合、读数等所有操作步骤，该快速测试方案可以在几分钟内完成。

图4. 使用单结合剂抗体sGP49对sGP进行快速电子检测，提高了传感性能

4.     血清和血液中sGP和RBD的检测

作者进一步评估了共结合纳米抗体在sGP和RBD传感中的应用(图5)，即sGP的sGP49/sGP7和RBD的RBD8/ RBD10(图2)，并在PBS、FBS、人血池(HPS)和全血(WB)中进行了快速检测。

此外，作者还揭示了系统的分析设计策略的重要性，从分子结合到信号转导和读出，以优化抗原检测。很明显，与单结合剂(sGP49, k _D 4.6 nM)相比，共结合剂对将LOD提高了10-100倍。

图5. 在不同的缓冲液中快速检测sGP和RBD

综上，本文展示了一种可推广和快速的检测设计和管道，显示出高灵敏度（sGP的检测限为∼10 pg /mL，0.13 pM；RBD检出限为∼ 40 pg/mL，1.3 pM），高特异性、大动态范围（~7 log）和数分钟内的快速读数。该方法在精确的抗原定量和早期感染检测方面非常可行。它还可以用于家庭或诊所的高频诊断，以及资源有限的地区，这可以大大加强对疾病传播的控制。未来，数字数据格式将减少人类对数据编制和报告的干预，同时促进快速和可访问的数据分析。Nano2RED可能会在当前的COVID-19大流行中立即被用于抗原和抗体检测，以及为未来不可预见的新疫情做准备。