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2022/08/10 Weekly Seminar
发布时间:2022-08-10

题目:使用羊毛角蛋白衍生的金属纳米酶作为强抗氧化剂催化剂来清除吸烟产生的活性氧

期刊:《Small》

IF:15.153

原文链接:https://doi.org/10.1021/acsnano.2c00008

汇报人:梁艳敏2020级硕士


基于生物分子(如蛋白质和氨基酸)和金属离子的自组装纳米结构在模拟天然酶的纳米结构、性质和功能方面有着广阔的应用前景。本文介绍了一种金属离子介导的自组装构建催化活性铜羊毛角蛋白(CuWK)二维纳米酶的方法。具体来说,通过引入铜离子作为非生物辅因子,WK可以作为蛋白质支架来设计和创建铜催化位点。具有Cu-WK配位框架的优化杂交体表现出显著的超氧化物歧化酶样活性、过氧化氢酶样活性和羟自由基清除能力。这些综合抗氧化活性使CuWK成为一种稳健的纳米酶,可有效去除各种活性氧(ROS)。在这项工作中,制备的CuWK作为一种新的添加剂,可以整合到卷烟滤嘴系统中,有效去除烟草燃烧产生的ROS。更重要的是,CuWK纳米酶作为一种关键元素,可以进一步用于构建可回收的香烟盒。因此,本工作表明可以通过金属离子和蛋白质的自组装来构建具有高级催化能力的纳米酶,从而有利于这类人工金属酶的合理设计和发现。

由于具有模拟酶性质的工程纳米材料(纳米酶)能够解决天然酶的局限性,例如低稳定性、高成本和储存困难,因此人们越来越关注它们。单原子纳米酶的合成过程通常通过高温裂解金属离子络合物的金属-有机骨架来进行。尽管前景广阔,但高温碳化通常会导致所得纳米酶的水溶性差,并出现氮掺杂的石墨状结构和缺陷。这些独特的结构和缺陷也可能具有类似酶的活性,这使得很难区分单原子纳米酶的活性来源。另一方面,受自然界生物矿化的启发,各种生物材料被广泛用作模板来指导纳米材料的合成,模板衍生的纳米材料往往具有很强的生物相容性。然而,这些模板衍生纳米材料的活性中心或结构与天然酶的活性存在根本性的差异。特别是基于生物分子与金属离子自组装的酶模拟物的制备受到了极大的关注。自组装允许生物分子(如氨基酸、蛋白质、嘌呤)通过非共价键相互作用与金属离子或人工酶结合,以更逼真地模拟天然酶催化中心。尽管这一领域已经取得了重大进展,但是开发具有多种抗氧化活性的金属纳米酶还只是一些初步的尝试。

近年来,全球约有11亿人吸烟。烟草燃烧产生的烟气中含有数以千计的化学成分,其中一些已经对人类健康造成了极大的危害甚至死亡。卷烟烟气中含有高浓度的活性氧(ROS),包括超氧化物自由基(·O2-)、过氧化氢(H2O2)和羟基自由基(·OH)。例如,燃烧一支香烟可以产生大约1016个自由基。因此,我们迫切需要一种能够有效清除活性氧保护人体的新型香烟滤嘴或烟嘴。

 

a) 羊毛纤维结构在不同放大倍率下的示意图以及模拟天然金属酶催化位点的 CuWK 纳米酶的设计和合成。 b) CuWK 纳米酶应用于香烟过滤嘴或烟嘴以去除香烟烟雾中产生的活性氧。

1.CuWk纳米酶的合成与表征 

图1. a) CuWK纳米酶的TEM图像。 b) CuWK纳米酶的HR-TEM图像。 c) 暗场 TEM 图像,以及 C、N、S、O 和 Cu 的相应 EDS 元素映射。 d) CuWK的XRD图谱。 e) EDTA、CuWK 和 CuWK + EDTA 的紫外-可见吸收光谱。插图左边是纯 CuWK 溶液的照片,右边是添加 EDTA 后 CuWK 溶液的照片。 f)羊毛角蛋白粉和CuWK的FTIR光谱。 g-k) CuWK 的 XPS 光谱:g) Cu 2p,h) C 1s,i) N 1s,j) O 1s,和 k) S 2p。

扫描电子显微镜(SEM)和低倍透射电子显微镜(TEM)显示成功合成了CuWK纳米酶纳米片结构(图1a)。此外,高倍透射电子显微镜(HRTEM)显示,我们所制备的材料没有表现出任何不同于具有良好限定的点阵条纹的其它铜基材料的点阵条纹。同时,Cu、N、S和O元素均匀地分布在纳米片的表面上(图1c)。结果表明,纳米酶中铜的结构既不是结晶的铜氧化物,也不是金属晶体结构。为了进一步证实所形成的CuWK纳米结构是通过金属-蛋白质络合法形成的,使用了一种与铜(II)的螯合能力比羊毛角蛋白更强的鳌合剂EDTA。当向含有1mg mL-1 CuWK纳米酶的悬液中加入EDTA时,悬液变为淡蓝色溶液,在约729 nm处具有强吸收峰(图1e)。以上结果表明,CuWK可能是由铜离子与羊毛角蛋白中的氨基、羧基和巯基自组装形成的。图1f显示,在引入Cu2+之后,与纯羊毛角蛋白相比,合成的CuWK纳米酶在FTIR光谱中表现出分裂和移动吸收。图1g、图1i和图1k表明,CuWK中的铜离子与WK上的氨基、巯基、羧基和羟基进行了复合连接。

2. CuWk纳米酶的类酶活性评价 

图2.a)CuWK纳米酶清除活性氧的示意图。 b)碘硝基四唑氯化物(INT)在不同浓度的CuWK纳米酶中与•O2-反应后的紫外-可见吸收光谱。 c)在不同浓度的CuWK纳米酶(蓝线)存在下INT与•O2-反应后在505 nm处的吸收峰和•O2-消除率取决于CuWK纳米酶的浓度(红线)。 d) CuWK纳米酶催化不同浓度H2O2产生O2的动力学曲线。 e)不同CuWK纳米酶浓度下O2产生的动力学曲线。 f) 在不同浓度的CuWK纳米酶下TMB与•OH反应后的紫外-可见吸收光谱。 g)在不同浓度的CuWK纳米酶(蓝线)存在下TMB与•OH反应后在652 nm处的吸收峰和•OH消除率取决于CuWK纳米酶的浓度(红线)。

图2d,e显示了10 min内的产氧速率,表明CuWK含量与CAT样活性呈正相关。这些结果也被所展示的气泡产生实验所证实。向H2O2溶液中加入CuWK会迅速催化许多O2气泡的产生。纯H2O2溶液中不产生气泡,而CuWK纳米酶-H2O2溶液中产生大量O2气泡。如图2f所示,与Fe2+/H2O2混合后,在652 nm处有一个清晰的吸收峰。添加CuWK时,吸收强度随着添加酶浓度的增加而显著降低,证明了CuWK的OH清除活性。当CuWK纳米酶的关注度提高至50g·mL-1时,可催化60.0%以上的OH分解(图2g)。上述结果表明,CuWK具有较强的清除活性氧的能力,优于目前使用的其他Cu基纳米酶。

3.去除卷烟烟气中活性氧的新型过滤嘴或烟嘴的研制

基于上述结果,我们将CuWK纳米酶填充到卷烟滤嘴中,去除烟草燃烧过程中产生的ROS(3a)。首先,使用INT检测CSE中的超氧自由基。如图3b所示,含CuWK纳米酶的CSE505 nm处的吸收峰显著降低。经计算,超氧自由基的清除效率高达94.9%(3e)。与不含CuWK纳米酶的CSE相比,含CuWK纳米酶的CSE荧光强度显著降低(3c),而过氧化氢去除率高达77.4%(3e)。如图3d所示,含CuWK纳米酶的CSE405 nm处荧光强度减弱。荧光强度降低,羟自由基清除率为45.7%(3e)

图3. a) 香烟烟雾提取装置。 b) 氯化碘硝基四唑 (INT) 催化氧化的吸收光谱:仅 INT(黑线); INT 和香烟烟雾通过未加载(红线)或(蓝线)CuWK 纳米酶的香烟过滤嘴。 c) 10-乙酰基-3,7-二羟基吩恶嗪 (ADHP) 催化氧化产生的荧光光谱:ADHP + 辣根过氧化物酶(黑线); ADHP、辣根过氧化物酶和香烟烟雾通过未加载(红线)或加载(蓝线)CuWK 纳米酶的香烟过滤嘴。 d) 对苯二甲酸 (TA) 的催化氧化产生的荧光光谱:只有 TA(黑线); TA 和香烟烟雾通过未加载(红线)或加载(蓝线)CuWK 纳米酶的香烟过滤嘴。 e) CuWK纳米酶填充卷烟滤嘴对•O2-、H2O2和•OH的去除效率。

为进一步开发CuWK纳米酶的应用,设计了一种新型卷烟滤嘴(图4a),并连续测试了5支卷烟对ROS的清除能力。图4b显示,新型烟嘴过滤器对ROS物种具有出色的清除效率和稳定性。O2-、H2O2、OH的催化效率分别可达72.4%、55.0%、40.6%。尽管我们开发的纳米酶在此阶段不能完全去除烟气中产生的所有活性氧,但我们的结果表明,CuWK纳米酶作为一种新型添加剂,在制造改进的香烟过滤嘴和烟嘴方面具有广阔的潜力。我们相信在不久的将来,通过合理设计新型人工金属酶可以进一步提高去除效率。

 

图4. a) 用于从香烟烟雾中清除 ROS 的回收烟嘴制备过程示意图。 b-d) 回收烟嘴对•O2-、H2O2 和•OH 的去除效率。

综上所述,本研究证明了羊毛角蛋白与金属离子自组装构建的CuWK纳米酶模拟多种抗氧化活性的潜力。与天然酶一样,得到的CuWK具有配位结构的活性Cu催化位点。通过调整制备条件,可以进一步提高CuWK纳米酶的催化活性。优化的CuWK纳米酶显示出固有的SOD样活性、CAT样活性和清除OH的能力。这些独特的性质使CuWK纳米酶能够有效去除不同的ROS。在我们的工作中,所制备的具有优异抗氧化能力的纳米酶被进一步用作卷烟滤嘴的新添加剂,以去除烟草燃烧产生的ROS。同时,CuWK纳米酶作为一种关键元件,可以进一步用于构建新型的可回收烟嘴。这些结果表明,基于WK和金属离子协同自组装的金属纳米酶的设计和开发,为构建人工酶提供了巨大的希望,并为探索新型香烟滤嘴和烟嘴的应用开辟了一条新的途径


题目:使用SpyTag/Spy捕获器定向固定化单结构域抗体,提高了检测限度

期刊:Analytical chemistry

原文链接:https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.analchem.9b02096

IF8.0

汇报人:廖星蕊 2020级硕士

 

许多单结构域抗体(sdAb),也被称为VHH或纳米抗体,已被开发用于免疫分析中的检测和诊断应用。sdAb来源于鲨鱼和骆驼中的重链抗体。它是最小的天然抗原结合域。sdAb虽然体积小,但对其抗原表现出较高的特异性和亲和力。然而,其也存在缺陷,由于尺寸小,它们与表面随机共价附着时会损害它们的结合功能。在血浆或血清等复杂基质中检测时,这一限制可能成为一个关键因素,这可能会显著降低检测的灵敏度。因此,为了在复杂基质中实现高灵敏度的检测,创造最有效的检测方法是必要的。

为了克服这一限制,已使用各种方法将sdAb定向固定到捕获表面上。其中包括许多非共价方法,例如加入生物素标记或与生物素结合蛋白融合表达虽然这些方法效果很好,但它们也有局限性。即使这种相互作用的亲和力非常高,在多重情况下,例如使用MagPlex微球时,储存时间延长可以能导致混合微球的抗体交换位置,导致假阳性或假阴性。分选酶连接是一种共价方法,虽然特异性很高,但通常连接效率低,需要延长反应时间。SpyCatcher/SpyTag对源自化脓性链球菌纤连蛋白结合蛋白FbaB,它包含赖氨酸和天冬氨酸之间的自发异肽键。将FbaB拆分为两个结构域,结合对所得片段工程改造产生了一个13氨基酸肽SpyTag,它与SpyCatcher结合并形成牢固的共价键。利用该系统提供sdAb捕获物的定向固定化以实现Luminex xMAP免疫分析。

本研究开发了几种sdAb和多聚sdAb结构,以其与SpyTAg肽融合。MagPlex微球首先与SpyCatcher蛋白一起功能化,然后与sdAb-SpyTag结构交联。初步试验显示,在葡萄球菌肠毒素BSEB检测中,定向单体、二聚体和三聚体sdAb捕获的能力优于非定向sdAb。接下来,使用SpyCatcher/SpyTag定向的二聚体sdAb检测了血清中登革病毒DENV非结构蛋白1NS1抗原的检测能力。与非定向二聚体相比,定向二聚体捕获表明在四种被加入人血清的DENV血清型中NS1检测限显著降低。最后,展示了通过使用SpyCatcher/SpyTag导向的sdAb二聚体捕获试剂来改进临床样本中DENV NS1抗原检测的潜力。

 

1 比较通过标准化学交联实现的sdAb的随机取向与使用SpyCatcher首次涂覆微球获得的高度取向的sdAb-SpyTag融合捕获表面的示意图。

本文,比较了使用标准EDC化学方法固定化的sdAb与通过SpyCatcher/SpyTag锚定的sdAb,如图2和图1所示。通过将含有CSpyTagsdAb结构与SpyCatcher功能化的MagPlex磁珠进行反应来实现定向固定化,相对于通过赖氨酸残基进行EDC交联,二聚体的性能优于单体或三聚体结构。通过将含有CSpyTagsdAb结构SpyCatcher功能化MagPlex结合实现定向固定相对于通过赖氨酸残基的EDC交联有效地改善了检测方案,其中二聚体优于单体三聚体结构 

2 固定方法在不同浓度下捕获SEB后信号比率除以背景的比较。ACVE-ACVE二聚体通过SpyTagST)尾部融合到C末端并由化学连接的SpyCatcherACVE-ACVE-ST-SC)结合在微球上,提供了最佳结果。

假设改善检测的策略是结合商业缓冲液,促进血清样品中信号的改善而不是非特异性结合,同时设计sdAb以实现更灵敏的测定。在比较DENV NS1产生的信号与用PBSTB稀释50%NHS与用LowCross缓冲液稀释50%NHS生成的信号时,观察到主要在低NS1浓度下改善了大约2倍,高浓度NS1产生的信号不受影响,表明LowCross缓冲液降低了NS1与其他血清成分的非特异性结合,改善了其对sdAb的可及性。2 

3 通过使用DD7-DD7-ST导向的捕获抗体与DD7-cs3K部分定向的DD7-GS3K,增强登革NS1检测。当捕获的sdAb与两种报告基因中的任何一种配对时,也实现了类似的增强:Bt-DD5-GS3KDENV NS1具有高特异性,或Bt-DD1-GS3K结合不同的表位并与西尼罗河病毒NS1发生交叉反应。样品一式两份,并使用两个单独的SpyCatcher珠子组。黑线表示比率为2

抗体工程涉及构建DD7二聚体,即NS1捕获sdAb,其中包含一个CSpyTag,该SpyTag可以定向固定在SpyCatcher包被的MagPlex珠上。DD7含有SpyTag的二聚体称为DD7-DD7-ST。进行了放大的xMAP检测,用于检测四种DENV血清型的NS1抗原,并将我们最初的捕获结果与赖氨酸尾巴(DD7-GS3K)进行了比较,其中DD7-DD7-ST通过常规EDC化学固定,DD7-DD7-ST通过SpyCatcher固定。使用SpyCatcher/SpyTag产生定向二聚体捕获导致所有浓度NS1信号增加,并导致对50%NHSNSI检测限显著提高。采用两种报告基因sdAb结构体DD5-GS3KDD1-GS3K进行分析;代表性结果如图3所示

 

4.从四种DENV血清型中检测NS1。使用两个不同的SpyCatcher磁珠组(蓝色和绿色)进行捕获,比较DD7-GS3K捕获(红色)和DD7-DD7-ST捕获。在所有情况下,DD1-GS3K都被用作报告器。未分化临床样本(UCS)和疟疾(Mal)、基孔肯雅病毒(CHIKV)阳性样本被列为对照。样本一式两份运行。信号与背景比高于2(黑线)的样本被标记为阳性

使用定向DD7-DD7-ST捕获和DD7-GS3K捕获对每个DENV血清型的有限临床样本进行评估,均与DD1-GS3K报告基因配对。结果如图4所示,使用定向二聚体可以可靠地检测DENV-1血清型中的NS1抗原,而使用原始DD7-GS3K捕获未检测到这些抗原。同样,从DENV-3检测到NS1从弱阳性增加到强阳性。使用定向二聚体可以稳健地检测来自DENV-1血清型的NS1抗原,而使用原始DD7-GS3K捕获未检测到该抗原。同样,从DENV-3中检测到的NS1从弱阳性增加到强阳性。出乎意料的是,即使使用定向二聚体捕获,也没有观察到来自DENV-2NS1检测。目前,尚不清楚为什么所制定的检测方法未能在此处测试的临床样本中检测到DENV-2血清型的NS1。从我们的对照珠组中获得的数据没有指出任何明显的原因。因此,一种可能性是被DD7识别的表位在这些患者血清样本中不可用。我们最初的想法是它被捕获但未被生物素化的sdAb识别,然而,当使用识别不同表位的不同sdAb进行测试时,未实现对DENV-2患者样本的检测的改进。另一种可能性是这些血清样本也具有干扰该测定的抗域抗体水平,但这仍有待证实。

一些研究发现,sdAb具有天然耐热性,暴露于高温后抗原仍结合,这表明它们非常适合于冷链稀缺的低资源地区的长期现场应用。基于sdAb的识别元件应具有传统抗体的特异性,具有在高温下使用和存储的潜力。在这里,利用它们的基因工程能力,制备了具有CSpyTag的二聚体sdAb结构,使sdAb更容易地定向到预先涂有SpyCatcher的微球上。该技术极大地改善了信号强度,使检测限提高了许多倍,并可能有助于sdAb适应各种诊断平台。