题目：用非晶态金属有机框架包装和输送酶
期刊：NATURE COMMUNICATIONS
IF：17.694
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-13153-x
汇报人：殷雪驰 2021级博士
细胞内代谢物的检测对于生物医学的应用非常重要，例如，癌症以及许多其他疾病的诊断。酶作为细胞内的催化剂，原则上可以加速特定的反应，将细胞内的代谢物转变成可检测的产品。细胞内的代谢物变成可检测的产品。细胞中的这种生物催化作用可以提供一种新的方法来精确检测活细胞中的代谢物。然而，酶的传递和在细胞中保留酶的活性仍然具有挑战性。
酶通常会在高温、极性有机溶剂、极端pH值和蛋白酶相互作用等恶劣条件下失去其三维结构，从未导致酶的严重失活。之前的工作已经致力于增加酶的稳定性以便在生物催化、生物传感和生物医学中得到广泛的应用。最近，结晶态金属有机框架（MOFs）作为一个有前途的候选材料，被用来在恶劣的条件下保护封装在MOFs内的酶。到目前为止，有两种方法可以将酶纳入MOFs中。最经常使用的策略是将酶吸附在预先合成的晶体MOFs中，这涉及到预先合成介孔MOFs，然后将酶分子加载到MOFs中精心设计的介孔中，这些介孔的尺寸略大于蛋白质分子。我们小组和其他小组提出的另一种方法是一步法，即在溶液中混合酶分子、金属离子和有机配体，以方便地形成酶-晶体MOF复合材料。然而，通过具有无序和模糊结构的无定形MOFs（aMOFs）来承载分子的可能性还没有被探索过。
本文在环境条件下将酶原位包装在aMOFs中。酶-aMOF复合材料的制备方法是一步到位的。酶-aMOF复合材料的制备通过一步法合成，只需将酶、金属离子和水溶液中的有机配体简单混合。延伸的X射线吸收精细结构（EXAFS）分析和分子动力学（MD）模拟表明，非晶态结构的形成主要是由金属离子和有机配体之间的配位缺陷造成的。通过低温电子断层扫描（Cryo-ET）观察到的aMOFs中的介孔封装的葡萄糖氧化酶（GOx）活性比晶体MOFs中高20倍。aMOFs为封装的酶提供了一个适当的保护，与天然酶相比具有更高的稳定性。这种酶- aMOFs复合物的高活性和稳定性使其可以应用于细胞内生物传感。通过aMOFs传递GOx，可以在单个活细胞中对葡萄糖进行非侵入性测量，从而从正常细胞中识别出癌细胞。这种能力在癌症诊断和了解肿瘤代谢方面具有很大的前景。
1. 酶-非晶态复合材料的合成
与先前报道的酶原位掺入结晶沸石咪唑框架8 (ZIF-8)相比，当降低2-甲基咪唑(2-MeIM)的浓度时，偶然发现了aMOFs中的酶包封。扫描电子显微镜(SEM)(图1a, b)和透射电子显微镜(TEM)显示，复合材料(含和不含酶)表现为纳米球的形态(直径约为100 nm)。高角度环形暗场扫描TEM图像和能量色散光谱(EDS)映射(图1c)证实了Zn和N(来自2-MeIM和蛋白质)在纳米球中的分布。随机光学重建显微镜图像(图1d)显示GOx在纳米复合材料中分布均匀。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)中1640 - 1660 cm−1和1510 - 1560 cm−1的特征吸收带再次证实了GOx的存在。经热重分析，复合材料中蛋白质的重量百分比约为10%。酶- mof纳米复合材料的选区电子衍射(SAED)图(图1e)显示了一种可能的非晶态结构，这与酶- zif -8复合材料的SAED图(图1f)有明显不同。因此，本文通过x射线衍射分析来检测酶- mof纳米复合材料的结晶度。与纯ZIF-8和酶-ZIF-8复合材料不同的是，加酶/不加酶的纳米复合材料(图1g)的XRD谱图显示了非晶态结构的存在。在这里，研究者认为仅通过调节有机配体的浓度，就可以在水溶液中制备出了aMOFs及其与蛋白质的复合材料。
图1. 酶-复合材料的结构表征
2. 非晶复合材料中的配位缺陷与介孔
根据aZIF中2-MeIM与Zn2+的比值，利用MD模拟研究了aZIF的形成过程。当2-MeIM与Zn2+的比例为2:1时，得到了稳定的ZIF-8结构(图2a)，平均孔径为1.2 nm(图2c)。当2-MeIM与Zn2+的比值降低到1.69:1时，发生骨架重排(图2b)。保留了一些类似于ZIF-8的有序结构。同时，2-MeIM与Zn2+的不规则配位导致骨架出现无序结构，从而导致分子坍塌，导致更大的孔隙产生(图2b)。通过对孔径分布的统计进一步证明了较大孔隙的出现，显示孔径在1.5 ~ 3.5 nm之间存在孔隙(图2c)，而晶体ZIF-8中仅存在0.3 ~ 1.2 nm的微孔。此外，模拟径向分布函数的结果也表明，aZIF中长距离阶数消失。通过同步辐射x射线对分布函数(PDF)实验，得到了ZIF-8和aZIF的总散射因子S(Q)，PDF和G(r)。实验结果与模拟得到的主峰吻合较好(图2e, f)，说明了模拟模型的准确性。此外，模拟得到的XRD谱图和模拟得到的原子对距离分布也与ZIF-8的晶体结构吻合得很好，再次证明了模型的正确性。
通过Cryo-ET成像，GOx-aZIF纳米复合材料的截面为直径约为100 nm的球形颗粒(图2g)，中孔均匀分布在颗粒内部。图2g清晰地观察到~1 ~10 nm范围内的介孔(图2h, i)。在Cryo-ET条件下，通过测量相邻两个峰的距离(图2h)或通过傅里叶变换(图2i)，沿图2g虚线的线性密度分布表明GOx-aZIF的孔径为1 ~ 10 nm。通过以上研究，本文得出结论，虽然本研究合成的复合材料保持了与结晶ZIFs相似的配位和化学组成，但低浓度的2-MeIM导致了框架中的配位缺陷。配位缺陷导致了分子的远距离有序度和结晶度的丧失，产生了具有额外介孔的azif和酶- azif纳米复合材料。
图2 酶- azif纳米复合材料的配位缺陷、介孔和活性
中孔的形成促进了底物葡萄糖进入GOx-aZIF纳米复合材料。利用荧光葡萄糖模拟物2-脱氧-2-[(7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑-4-基)氨基]- d -葡萄糖(2-NBDG)证明了底物对酶- azif复合物的高亲和力。2-NBDG与GOx-ZIF-8或GOx-aZIF纳米复合材料在相同条件下孵育。GOx-aZIF纳米复合材料荧光强度增强较快，在6min后达到平台期，而GOx-ZIF-8由于ZIF-8中微孔的扩散屏障较强，荧光强度要弱得多。孵育10 min后，GOx-aZIF纳米复合材料比GOx-ZIF-8捕获更多的荧光分子(图2j)。
3. aZIF包装酶活性高
基质运输的便利促使研究者测量GOx-aZIF纳米复合材料的活性。令人惊讶的是，在相同蛋白浓度下，与天然GOx相比，GOx- azif纳米复合材料的相对活性几乎达到了100%。这一结果比GOx-ZIF-8复合材料的活性(~5%)高出20倍(图2k)。进一步研究GOx- azif纳米复合材料的酶学动力学表明，封装GOx的Michaelis-Menten (MM)常数Km为2.0mM，而未封装GOx的Km为2.2mM，表明其与底物葡萄糖的亲和力相似。相比之下，对于封装在ZIF-8中的GOx, Km增加到12 mM，表明衬底运输受到严重限制。我们知道，ZIF-8具有~3.4 Å的空腔，这严重限制了底物的运输，因此封装后酶活性显著降低。同样，aZIF复合材料中CAT和CALB的活性比相应的ZIF-8复合材料中高约5倍(图2l)。为了解释aZIF中GOx、CAT和CALB活性增强因子不同的原因，本研究建立了扩散-反应模型。从研究结果观察到，aZIF从非晶态结构到晶态结构的演化具有时间依赖性，酶的类型可能会影响演化时间。配体的投料浓度也会影响包覆酶的活性和复合物的结构。这说明有机配体浓度和反应时间的良好控制导致了非晶态结构的形成。
动态光散射分析表明，GOx-aZIF纳米复合材料可以很好地分散在水溶液中，平均尺寸约为150 nm，zeta电位为−23 mV(补充图43)。与GOx-ZIF-8 (+25 mV)的正zeta电位相比，负zeta电位的GOx-aZIF与细胞孵育时的生物相容性更好。GOx-aZIF纳米复合材料在水溶液中有轻微的团聚现象，导致其尺寸比SEM图像中得到的尺寸大。这种保护结构可以防止被包裹的酶受到蛋白酶的攻击。与GOx-ZIF-8相似，将GOx-aZIF纳米复合材料浸泡在胰蛋白酶溶液中，其活性几乎保持了原来的100%(图2m)。进一步的实验也表明，GOx被包裹在颗粒内部，而不是吸附在aZIF表面。相反，在相同条件下，游离GOx被胰蛋白酶消化，导致活性丧失80%。总的来说，aZIF包覆的酶在活性回收率、稳定性、水分散性和可及性等方面优于其他介孔材料，如水凝胶和介孔二氧化硅。
4. 酶-azif检测细胞内葡萄糖
酶- azif纳米复合材料在生理条件下具有较高的活性、分散性和稳定性，使本研究可以实现细胞内代谢物的检测，代谢物的浓度通常是生化过程的重要指标。在相同的酶用量下，Gox-aZIF的活性明显高于GOx-ZIF-8，表现为较高的初始斜率和较高的FI峰值。这种优势在不同的酶浓度下都存在，特别是在中等剂量(约15 μg mL−1的纳米复合材料)，而GOx-aZIF的峰值FI是GOx-ZIF-8的4倍。在低剂量(4.5 μg mL−1 GOx-aZIF和GOx-ZIF-8)下，酶在细胞内传递后，大部分GOx-aZIF和GOx-ZIF-8可能在催化足够的葡萄糖之前就失活了，从而产生GOx-aZIF和GOx-ZIF-8之间的微小差异(图3a，左)。在中等浓度下(15 μg mL−1)，GOx-aZIF与GOx-ZIF-8的酶活差异明显且清晰可见(图3a，中)。这是因为GOx-aZIF的高活性使其能够催化细胞内葡萄糖。而GOx-ZIF-8在中等剂量时活性仍然极低。由此可见，GOx-aZIF和GOx-ZIF-8的荧光动力学差异很大。在高浓度(45 μg mL−1)时，由于GOx-aZIF和GOx-ZIF-8都过量，大部分葡萄糖都以相似的速度快速消耗(图3a，右)，从而产生相似的性能。这些结果共同证实了GOx-aZIF用于动态葡萄糖检测的可行性。
本研究进一步研究了单细胞、混合细胞中葡萄糖的分析，以及对不同细胞类型的区分，以证明其实际应用。如图3c, d所示，以GOx-aZIF为探针，基于单细胞水平对细胞内荧光信号的高灵敏度，可以很容易地将摄取更多葡萄糖的活性细胞(1-3个)与相对静止的细胞(4-6个)区分开。此外，它还可以用来区分癌细胞(HepG2)和正常肝细胞(L02)(图3e, f)，因为HepG2细胞摄取更多的葡萄糖，导致更高的荧光强度。为了进一步研究，首先用标准的化学裂解法测定了四种不同细胞类型的细胞内葡萄糖浓度，葡萄糖浓度从正常组织细胞(L02)增加到癌细胞(MGC803 < MCF-7 < 4 t1)。将GOx-aZIF注入细胞后，无创伤检测不同细胞类型的DCF荧光强度(图3g, h)，进入不同细胞的GOx-aZIF保持相同数量;因此，DCF强度的峰值反映了GOx-aZIF催化葡萄糖的量。用标准化学裂解法测定葡萄糖浓度时，DCF峰值强度值相应增加(图3g)。荧光强度与细胞内葡萄糖浓度之间的线性相关可以作为校准曲线。从这个意义上说，GOx-aZIF不仅保证了葡萄糖的绝对定量，而且超越了化学裂解法，开创了一种温和、无损伤的活细胞检测方法。
图3 将酶送入癌细胞进行原位葡萄糖检测
综上所述，我们认为aMOFs可以包装具有较高保留活性的酶。我们研究了aZIF的化学结构，证明了aZIF在形成非晶态结构和蛋白质分子掺入过程中产生了1 ~ 10 nm的中孔。这些中孔有利于底物的运输，从而大大提高了被包埋酶的活性，不同类型的酶都证明了这一点。通过aZIF传递GOx，可以在单个活细胞中动态检测葡萄糖，这可以用于区分不同的细胞类型，并区分正常细胞和癌细胞。这也为温和、高效地检测其他细胞代谢过程提供了思路，并促进了新型药物给药系统的开发。