Weekly Seminar

题目：一种多功能的纳米酶集成比色和光热横向流动免疫分析法用于高灵敏和可靠的黄曲霉检测

期刊：Biosensors and Bioelectronics

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956566322004754

IF：12.545

汇报人：王绍弛  2020级博士

比色免疫测定法，特别是比色横向流动免疫测定法(LFA)，作为流行和有前途的护理点检测(POCT)策略，分析结果可通过肉眼直接读出，无需其他复杂设备，具有重要的前景仪器。因此，由于其操作简单、便携、经济，尤其是在资源有限的环境下，被广泛应用于疾病诊断、环境监测和食品安全等领域。然而，依赖比色LFA颜色的出现和消失来识别分析物，其有限的灵敏度仍然不能适应其实际应用。近年来，人们致力于构建提高LFA灵敏度的信号放大器。然而，这些LFA大多依赖于单一的比色模式，容易受到外部干扰，如不同的操作人员、非标准的测试过程和不同的外部环境。因此，在实际应用中，单模态检测不能满足复杂实际样品的高精度检测要求。尽管具有挑战性，但构建多模态LFA (mLFA)以满足对分析性能的高度敏感和准确分析性能的不同需求迫在眉睫。

纳米酶作为LFA中的信号标记单元，不仅可以读取其固有的原始比色信号，还可以通过其酶催化活性提供放大的比色信号，这些特性使纳米酶在高灵敏度比色POCT纳米平台的构建中具有吸引力。近年来，酶模拟和光热性能双功能纳米酶在多模式肿瘤治疗和病原体生物膜根除方面受到了广泛关注。这些有效的双功能纳米酶平台可以扩展到比色法和光热热多模态检测，以显著提高其灵敏度、准确性和可靠性。然而，用于开发多模态POCT的双功能纳米酶平台尚未得到充分研究。此外，开发一种易于控制的多功能纳米酶探针对某些单元的合成、功能修饰和组装具有重要意义。

因此，我们旨在探索一种简单有效的方法来构建一种紧凑的具有酶模拟和光热特性的mLFA双功能纳米酶。金属/金属氧化物纳米颗粒(NPs)因其出色的模拟酶活性在LFA领域得到了广泛的应用。其中，铜(Cu)-和铜相关的NPs具有显著的模拟过氧化物酶活性，但由于其不稳定性和分散性差，难以高效应用。因此，迫切需要以配体为骨架的铜基纳米复合材料来锚定Cu离子，并在原位形成催化位点。Pol[1] y多巴胺(PDA)由于其在官能团(如邻苯二酚、胺和亚胺)和铜离子之间的强亲和力[1]，已成为锚定Cu离子形成Cu-和/或CuOx NPs的强大骨架。具体来说，多巴胺(DA)的还原性研究旨在开发一种不添加还原剂和/或表面活性剂的环境友好型Cu/CuOxNPs-PDA纳米组装(PCu)。此外，PDA在近红外区域具有很强的吸收，使其成为多功能支架的迷人候选材料。

在这里，一个稳定的PCu材料被成功开发，作为一种多功能的纳米探针构建比色和光热mLFA放大平台。本文使用黄曲霉(a . flavus)作为方法验证的目标物。本文采用一种多功能PCu组装体介导的mLFA，采用三明治结构分析原理实现了黄曲霉快速、稳定和高效的分析性能。开发的PCu具有良好的过氧化物模拟活性和光热活性，有助于黄曲霉的高灵敏度和高精度测定。

  视觉模式的免疫层析分析(LFA)被认为是具有吸引力的即时检测(POCT)生物分析策略；然而，较低灵敏度和可靠性限制着其进一步发展。在本文中，中国农业科学院李培武院士团队通过一步法，将具有催化位点的铜纳米颗粒与具有光热性能的聚多巴胺(PDA)支架相结合，开发了一种小型的Cu-anchroed PDA (PCu)作为多模式LFA (mLFA)的信号识别元件。具有过氧化物模拟和光热特性的PCu，可以同时提供三种信号输出方式用于检测Aspergillus flavus (A. flavus)，包括比色信号、比色信号放大以及光热信号。基于此，多重检测模式的PCu-based mLFA能够准确、灵敏地检测黄曲霉菌丝生物量，分别低至到0.45和0.22 ng mL−1，其灵敏度相比于传统比色法分别提高了19和40倍。此外，所建立方法在实际样品中进行了验证，回收率为89.9 ~ 109%，具有较高的可靠性。该研究为构建高效的过氧化物酶模拟物和优良的光热多功能纳米材料铺平了道路。

1. 多功能PCu-based LFA的设计原理

多功能PCu通过简单的一步DA介导的聚合、掺杂和原位还原过程制备（Scheme 1）。作为一种极具吸引力的聚合前驱体，DA可以高效富集和原位沉积/还原Cu2+，不需要额外的还原剂、表面活性剂或聚合物，有效地避免了复杂的制备过程。通过Figure 1A可以看出，PCu-based mLFA被成功合成，TEM观察其直径为290nm。HAADF-STEM及相应的元素映射分析表明，PCu中Cu、C、N、O元素分布均匀（Inset of Fig.1A）。EDS也证实了PCu类似的化学组成（Fig.1B）。这些组成元素均匀分布在PCu中，证明了其被成功合成（Fig.1C）。SEM分析表明，在PDA支架上原位形成NPs后，PDA的表面由光滑变为粗糙（Fig.1D）。随后用x射线衍射图(XRD)研究了多功能PCu的晶体结构，结果表明，PCu中可能存在Cu0和Cu+成分（Fig.1E）。PCu的拉曼光谱在1360和1560 cm-1处显示了D和G波段的两个代表性峰，与PDA相比，PCu组装的G波段峰移动了15 cm-1 (Fig.1F)，证实了PDA支架上纳米颗粒的成功构建。利用XPS研究了PDA和PCu组件的化学组成，进一步证明了PCu的形成（Fig. 1G and H）。

Scheme 1.黄曲霉mLFA纳米平台的构建。(A) PCu@pAb探针的制备，(B)夹心原理用于黄曲霉过氧化物酶比色和光热多模态分析示意图。

Figure 1. PCu的表征。(A) PCu的TEM，Inset:暗场扫描图像，(B) PCu C, N, O, Cu对应元素映射分析，(C) PCu对应的EDS，Inset:C, N, O, Cu元素的重量和原子百分比。(D) PCu的SEM表征。(E) PCu的XRD。(F) PCu和PDA的拉曼光谱。(G) PCu和PDA的XPS测量谱。(H) PCu的高分辨率Cu-2p XPS光谱。
2.PCu的酶活性能和光热性能

金属和金属氧化物NPs通常被用作过氧化物模拟催化剂。利用具有代表性的3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)底物在H2O2的辅助下探究模拟过氧化物酶的PCu组装(Fig.2A)。与无色TMB/H2O2体系相比，PCu/ H2O2/TMB体系表现出从无色到蓝色的明显颜色反应，提供可视化信号。在验证了PCu催化过氧化物模拟性能后，通过评价可能的活性中间体，探讨了PCu纳米酶的催化机理。通过DMSO和TEMPO作为·OH和·O2-的清除剂，间接发现PCu纳米酶产生的ROS种类。如图2B所示，DMSO清除的PCu/ H2O2/TMB体系的紫外可见吸收相对于TEMPO显著降低。不同活性氧自由基对dmso -•OH的清除率为80%，紫外-可见光谱表明其优势活性成分为•OH。此外，以5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide (DMPO)为捕获剂，通过电子自旋共振(ESR)光谱直接确证了过氧化物模拟PCu生成的OH产物。与单个PCu纳米酶和H2O2的微弱信号相比，PCu/ H2O2体系中1:2:2:1的信号强度比代表了一个特征的DMPO-HO·加合物，表明PCu纳米酶催化过程中存在•OH中间体（Fig.2C）。结果表明，PCu纳米酶具有模拟过氧化物酶的活性，能有效地生成•OH中间体。Fig 2D，2E和2F中，主要探究了PCu的光热性能，在808 nm，1.5 W cm2的近红外激光照射下，PCu的温度可以从27℃急速上升到55.9℃。表明PCu具有优越的光热性能。

Figure 2. PCu组件的过氧化物酶和光热性能。（A）紫外吸收 (a) H2O2, (b) TMB, and (c) TMB + H2O2, (d) PCu + TMB, (e) PCu + H2O2, (f) PCu + TMB + H2O2. TMB: 2 mM, H2O2: 5 mM；（B）活性氧清除测定(a) PCu + TMB + H2O2, (b) PCu + TMB + H2O2+TEMPO, (c) PCu + TMB + H2O2+DMSO（C）ESR (a) PCu assembly, (b) H2O2, (c) PCu + H2O2. (D) Heat curve of PCu assembly (111 μg mL-1) 在808 nm不同激光密度下的热曲线。(E)不同PCu浓度下的热曲线。（F）PCu对应的热像图(74 μg mL−1) (a) 0min，(b) 1min，(c) 3min，(d) 5min (808 nm, 1.5 W cm−2)。

3.信号探针的构建

基于多功能PCu信号探针的成功构建，PCu被应用于建立通用传感平台，用于生物分析物的多模式分析。通过引入抗黄曲霉的多克隆抗体（pAb），构建基于PCu的传感系统。PDA涂层中的琨基参与蛋白质氨基酸残基与SH和NH2的亲核加成反应，从而促进pAb在PCu组装中的固定化。作者通过UV-vis，FT-IR，Zeta电势与DLS表征证明了pAb的成功固定（Fig 3A-D）。通过测定PCu@pAb上清液的紫外可见吸收光谱，探究pAb的负载效率。结果表明，在固定的PCu组件下，随着pAb用量的增加，PCu组件上封装的pAb明显增加（Fig 3E）。特别是PCu@pAb的加载效率随着pAb浓度的增加而增加。当pAb浓度为60 μg m-1时，计算出pAb在PCu上的饱和加载效率为87.6%（Fig 3F）。

Figure 3. PCu@pAb的制备。(A) UV-vis，(B) FT-IR，(C) PCu，pAb和PCu@pAb的Zeta电位。(D) PCu和PCu@pAb的DLS。(E) pAb在PCu支架上的负载量。(F) pAb在PCu支架上的负载效率。误差条表示三个独立实验的标准差。

4.    实验条件的优化

本文主要对信号探针的浓度，催化时间以及光热检测时间进行了优化。结果表明，24 μg/L的探针含量为最佳浓度，最佳的催化时间和光热检测时间为30s和3min。通过探究优化实验条件，成功构建了针对黄曲霉高效稳定的mLFA方法。（Fig 4）

Figure 4 实验参数的优化条件。(A) PCu@pAb含量的优化，(B) TMB/H2O2体系的优化和(C)近红外激光照射检测时间的优化。误差条表示三个独立实验的标准差。

5.    黄曲霉的mLFA测定

本文利用mLFA在最佳条件下评估其对黄曲霉的分析性能。通过比色信号、比色信号放大器和热信号读出，用mLFA分析不同浓度的黄曲霉。随着黄曲霉浓度的增加，检测线的比色信号明显增强，这与三明治结构的形成和基于PCu@pAb比色读出器的高效生成相一致。排除非特异性信号，用空白组检测线强度与阳性组检测线强度之比对结果进行量化。Fig 5A表明，（I-I0）/ I0与黄曲霉浓度呈线性关系，回归方程为(I–I0)/I0 = 0.938 + 0.379 lgC，R2=0.997。检测限为8.7 ng mL-1，该结果是已报道ELISA方法的114倍。酶催化比色信号放大方法的回归方程为(I I0)/I0 = 2.256 + 0.582 lgC (R2 = 0.989)，与传统比色法相比，mLFA的过氧化物酶样活性明显提高了灵敏度。光热检测模式下，回归方程为ΔT = 10.714 + 3.014 lgC (R2 = 0.994)，ΔT与黄曲霉浓度的对数(0.001 100 μg mL 1)呈线性关系。根据3σ/S，过氧化物酶样扩增比色法和光热法的检出限分别为0.45和0.22 ng mL-1，甚至优于大多数以免疫分析为基础的黄曲霉检测方法。与传统比色法(8.7 ng mL-1)相比，灵敏度显著提高了19倍和40倍。在实际样品中，花生基质中mLFA的检测性能与花生基质相似，比色、放大比色和光热检测的LOD分别为2.2、0.20和0.14 μg g-1 (玉米基质为1.8、0.16和0.11 μg g-1)。此外，该方法具有较宽的检测范围，对不同水平要求的分析物具有较大的检测潜力。此外，mLFA的检测范围也相对较宽，为不同水平要求的分析物提供了很大的潜力。结果证实基于PCu@pAb的mLFA可作为黄曲霉高效灵敏的检测平台。

Figure 5．多功能信号输出分析黄曲霉。(A)黄曲霉比色法检测(0.01 ~ 1000 μg mL−1)。(B)放大比色[1]法检测黄曲霉(0.001 ~ 1000 μg mL−1)。(C)黄曲霉对温度的反应(0.001-1000 μg mL−1)。(D)黄曲霉对其他潜在干扰的特异性。a: A. flavus, b: Escherichia coli, c: Bacillus subtilis, d: Trichoderma, e: Aspergillus ochraceous, f: Aspergillus ostianus, g: Penicillium polonium。

综上所述，一种多功能PCu被成功开发，用于高效的mLFA检测平台。通过将比色和光热模态有效地整合为一个实体，PCu显著提高了比色mLFA的灵敏度和可靠性。基于PCu的mLFA体系的过氧化物酶模拟(peroxidase-mimics)和光热特性使其LOD分别为0.45和0.22 ng mL−1，与传统比色法(LOD为8.7 ng mL−1)相比，分别提高了19和40倍，对黄曲霉菌丝体生物量具有高度的特异性识别，同时在实际样品中也表现出了优异的分析性能。与传统的比色LFA相比，PCu介导的mLFA通过结合多个传感策略，为详细合理构建更高效、更稳定的POCT策略提供了理论支撑，为食品安全和生物分析提供了一个更通用、更吸引人的分析纳米平台。