Weekly Seminar
题目：Ultrasensitive and multiplex detection of four pathogenic bacteria on a bi-channel lateral flow immunoassay strip with three-dimensional membrane-like SERS nanostickers
期刊：Biosensors and Bioelectronics
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956566322005656?via%3Dihub
IF：12.545
汇报人：刘思杰 2021级博士
用于敏感和多路现场检测细菌的侧向流动免疫测定(LFA)技术仍存在挑战。在此开发了一种基于双通道表面增强拉曼散射(SERS)的LFA，使用3D膜状SERS标签作为纳米贴纸（命名为 GO@Au/Ag），用于对多种病原体进行直接和超灵敏分析测试。将大量银卫星嫁接到纳米贴纸上显著增加了细菌结合的相对表面积，并在大面积上产生了有效的SERS热点，以提高传感灵敏度。抗体标记的GO@Au/Ag纳米贴纸可以快速粘附在目标细菌上，并在纸条上产生优异的SERS信号和流动性，从而克服细菌大小的不利影响，提高LFA的多重分析能力。将两种不同的拉曼报告分子整合到纳米贴纸中，可以在两条测试线上同时检测四种病原体，从而显着简化SERS信号的读取过程。所提出的生物传感器可以定量检测实际临床样本中的四种不同细菌，检测限低，检测时间短（20分钟），准确度高，稳定性好，表明其在现场病原体检测中的巨大应用潜力。
基于快速色谱分离和抗体-抗原特异性识别的侧流免疫分析（LFA）已发展成为最流行的即时检测（POCT）技术，具有成本低、便携、易用、实时等显着优势分析。传统的 LFA 方法依赖于基于胶体金 (AuNP) 的比色信号，通常表现出定性或半定量能力和有限的灵敏度。幸运的是，通过引入新的信号模型，例如荧光、化学发光、磁性和拉曼信号，LFA 系统的灵敏度和准确性得到了极大的提高。然而，LFA技术在直接检测细菌方面仍面临三大挑战。首先，与LFA的硝酸纤维素（NC）膜的孔径（一般为6-15μm）相比，细菌细胞的尺寸太大（一般为0.6-5μm）。尽管大孔NC膜（孔径>12 μm）可以为细菌通过提供宽通道，但它们也减少了在测试线上形成的细菌-纳米标签免疫复合物的数量，导致检测灵敏度降低。其次，LFA常用的纳米标签是球形胶体纳米粒子（NPs）或复合纳米球，它们与细菌表面结合，从而增加了形成的细菌-纳米标签复合物的尺寸，削弱了它们在条带上的分散性。第三，真实细菌样本（如临床标本、食品基质）中的复杂成分（如酸、高盐、蛋白质、细胞碎片）容易影响传统LFA纳米标签的胶体稳定性，产生无效甚至错误的结果。在这方面，目前开发的 LFA 方法检测性能不足，包括灵敏度低、通量低和对细菌检测的普遍性差。迄今为止，尚未报道允许对病原体进行多重和灵敏检测的LFA技术。
表面增强拉曼散射 (SERS) 是一种强大的振动光谱技术，可以显着增强吸附在贵金属纳米材料上的分子的拉曼信号，产生超强（单分子水平灵敏度）、特异性（指纹光谱）和稳定（无光漂白）用于目标量化的光信号。最近的研究表明，与 SERS 集成可以大大提高 LFA 的灵敏度、定量能力和多重检测能力。尽管已经提出了多种 SERS 纳米结构，例如球形 AuNPs、Au@Ag NPs、SiO2@Au、Fe3O4@Ag/Au 和含有纳米间隙的 AuNPs，但用于细菌检测的理想标签尚未开发出来。
示意图： (a) 3D GO@Au/Ag SERS 纳米贴纸的合成示意图，(b) 免疫-GO@Au/Ag SERS 标
签的制备，以及(c) GO@Au/Ag 基SERS-的机理- LFA 用于多重检测四种细菌。
3D GO@Au/Ag 纳米贴纸的合成涉及在单层 GO 纳米片表面上进行的四个连续步骤。 首先，我们使用带正电荷的聚合物 PEI 来涂覆 GO 片材并将致密的小 AuNPs（3 nm）吸附到 GO 表面作为后续 Au 壳生长的种子位点。其次，我们使用种子介导的生长策略将粗糙的金壳还原到 GO-Au 种子纳米片的表面。第三，我们通过控制超声时间将超窄 PEI 层（0.5 nm）精确地涂覆在 GO@Au 表面作为内置纳米间隙，以提供可以容纳 DTNB/MBA 分子的位点并将许多 AgNPs 固定为卫星。最后，我们通过静电相互作用将大量 30 nm AgNPs 牢固地固定在 GO@Au 纳米片的 PEI 层上。外部组装的 AgNPs 卫星将 2D GO@Au 纳米片转换为具有更大表面积和多个 SERS 热点的 3D GO@Au/Ag 纳米贴纸。对3D GO@Au/Ag 纳米贴纸的表征验证结果如图1所示。
图 1. 3D GO@Au/Ag 纳米贴纸的表征。(a) GO、(b) GO-Au 种子、(d) GO@Au、(e) GO@Au-PEI 和 (g) GO@Au/Ag 纳米贴纸的 HRTEM 图像。(c) GO-Au 种子、(f) GO@Au-PEI 和 (h-i) GO@Au/Ag 纳米胶的局部形态的放大 TEM 图像。(j) EDS 元素映射图像和(m) GO@Au/Ag 纳米贴纸的 EDS 元素线扫描结果。 (k) 每个阶段的纳米片的 Zeta 电位。(l) GO@Au 和 GO@Au/Ag 的 HAADF-STEM 图像。
图 2. PEI 涂层 GO@Au 的 TEM 照片，PEI 壳层厚度为 (a) 0 nm、(b) 0.5 nm、(c) 1 nm 和 (d) 2 nm。(a) 30 nm AgNPs 和具有 (f) 0.5 nm、(g) 1 nm 和 (h) 2 nm 的内置纳米间隙的 GO@Au/Ag 纳米贴纸的 TEM 图像。(i) 用于 FDTD 计算的 GO@Au/Ag 纳米结构的 3D 模型。(j) GO@Au/Ag 上的 EM 场分布，在 785 nm 波长处具有 0.5 nm 纳米间隙。颜色条表示 log(|E/E0|2)。(k) SERS 光谱和 (l) 吸收在不同纳米材料上的 DTNB 在 1328 cm-1 处的 SERS 强度。(m) DTNB 修饰的 GO@Au/Ag（红线）和 MBA 修饰的 GO@Au/Ag 标签（蓝线）的 SERS 光谱。选择 1328 cm-1 用于 DTNB 和 1585 cm-1 用于 MBA 以在一条测试线上定量检测不同的细菌。
对于SERS技术，具有狭窄内部间隙（<2 nm）的等离子体纳米粒子已被证明是最有前途的 SERS 探针，因为 Au 或 Ag 纳米结构中的均匀纳米间隙是有效的 SERS 热点，产生最强且可重复的 SERS信号。在此，将精确的亚 2 nm PEI 层引入 GO@Au/Ag 纳米贴纸中，作为 GO@Au 和 Ag 卫星之间的内部间隙。如图 2a-d 所示，GO@Au 表面上 PEI 中间层的厚度可以很容易地调整为 0、0.5、1 和 2 nm，对应于 0、10、20 和 30 的反应时间分钟。所有这些制造的 GO@Au-PEI 都可以将 30 nm AgNPs 均匀牢固地粘附在它们的表面上，这可以将 2D GO@Au 转化为 3D 纳米膜（图 2e-h）。且PEI 层是一个多孔壳，允许拉曼染料分子自由进入。在超声处理过程中，DTNB/MBA 分子可以穿过多孔 PEI 层并进入内 Au 壳和外 Ag 卫星之间的纳米间隙，从而产生来自 DTNB 或 MBA 的强而稳定的 SERS 信号。通过将 0.5、1 和 2 nm PEI 夹层 GO@Au/Ag 与 DTNB 溶液 (10 μM) 一起孵育，研究了 PEI 层厚度对 3D 纳米贴纸 SERS 活性的影响。如图 2k-l 所示，通过比较主要的拉曼峰，具有 0.5 nm PEI 层的 GO@Au/Ag 产生最强的 SERS 信号，大约是裸 GO@Au 纳米片和 AgNPs 的两倍和四倍。此外，DTNB 修饰的 GO@Au/Ag 的 SERS 强度随着 PEI 层厚度（0.5-2 nm）的增加而明显降低。为了研究 Ag 卫星数量对 GO@Au-PEI 表面的影响，比较了 GO@Au/Ag-DTNB 在不同 AgNPs 吸附时间（0-40 分钟）下的 SERS 性能，结果表明完全吸附 AgNPs 的 GO@Au/Ag 纳米贴纸表现出最好的 SERS 活性。因此选择了具有 0.5 nm PEI 层和完全吸附 Ag 卫星的 GO@Au/Ag 来构建 SERS-LFA 系统。且所提出的 GO@Au/Ag 纳米贴纸的 SERS 增强因子 (EF) 计算为 1.95 × 108。为了研究纳米贴纸的热点分布，进行了有限差分时域（FDTD）方法。如图 2i 所示，构建了具有 0.5 nm 的 Au-Ag 粒子间隙（PEI-gap）的 GO@Au/Ag 纳米胶的 3D 模型，其在 785 nm 入射波长下的计算结果如图 2j 所示。由于电磁场耦合效应，在金壳的邻域金纳米粒子之间以及金壳与嫁接的银卫星之间的间隙处产生了巨大的热点。间隙等离子体共振（GPR）在混合表面等离子体效应中发挥着至关重要的作用。通过嫁接银卫星，热点的数量显着增加。同时，通过控制与PEI层的间隙宽度，可以调节引入热点的强度，热点的最大强度达到2153倍。
图 3. (a-b) GO@Au/Ag 纳米贴纸的稳定性：(a) 颜色变化和 (b) 胶体 AuNPs、AgNPs 和 GO@Au/Ag 在不同盐浓度（0-1000 mM NaCl）下的紫外光谱。 (c-n) 常见 AgNP 标签和 GO@Au/Ag 纳米贴纸的结合能力比较。形成的细菌-胶体 AgNPs 标签复合物的 TEM 图像：(c) L. mono-AgNPs，(d) S. aureus-AgNPs，(e) E. coli-AgNPs，和 (f) S. typhi-AgNPs。形成的细菌-GO@Au/Ag 复合物的 TEM 和 SEM 图像； (g, k) L. mono-GO@Au/Ag, (h, l) S. aureus-GO@Au/Ag, (i, m) 大肠杆菌-GO@Au/Ag，和 (j, n) S. typhi-GO@Au/Ag。
由于其在高度稳定和亲水的 GO@Au 纳米片上集成了大量的 Ag 卫星，因此膜状 GO@Au/Ag 表现出比普通胶体 Au 或 AgNPs 更好的稳定性。如图 3a-b 所示，GO@Au/Ag 悬浮液的比色和紫外可见光谱在高盐溶液（0-1000 mM NaCl）中保持稳定，而常用的胶体 AuNPs 和 AgNPs 在之后严重团聚。纳米贴纸优异的化学/SERS稳定性确保了它们在复杂样品中的实际应用以及SERS-LFA系统在复杂环境下的高可靠性。与传统的胶体纳米标签相比，抗体标记的 GO@Au/Ag 具有更大的表面积、更多的表面结合位点和更灵活的薄膜结构，不仅提供更强的 SERS 信号，而且对目标病原体的结合效率更高。图 3g-j 中的 TEM 图像和图 3k-n 中的 SEM 图像清楚地表明，膜状 GO@Au/Ag 可以快速而紧密地粘附目标细菌（L. mono，S.金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和伤寒沙门氏菌）。相比之下，在相同条件下，抗体修饰的 AgNPs 在细菌上的量明显低于纳米贴纸的量（图 3c-f）。以上所有结果表明，GO@Au/Ag纳米标签与细菌结合不仅提供了比普通胶体SERS标签更高的SERS信号，而且提高了细菌细胞在LFA系统上的分散性和流动性。
图 4. 构建基于 GO@Au/Ag 的 SERS-LFA 系统，通过两条检测线对四种细菌进行多重检测。 (a) 基于 GO@Au/Ag 的 SERS-LFA 的 (b) T1 线和 (c) T2 线上的照片和相应的 SERS 信号，用于评估四种细菌的 (strip 1)的交叉反应性，（条带 2）伤寒沙门氏菌，（条带 3）大肠杆菌，（条带 4）金黄色葡萄球菌，（条带 5）L. mono，和（条带 6）空白对照。用于目标细菌检测的相应测试线的典型 SEM 图像：(d) 伤寒杆菌，(e) 大肠杆菌，(f) 金黄色葡萄球菌，(g) L. mono，和 (h) 空白对照。 (i) 优化 SERS-LFA 条上的运行缓冲液，用于在一条测试线上检测两种细菌。 (j-k) T1 线 (j) 和 T2 线 (k) 上抗体浓度的优化。
通过基于纳米贴纸的 LFA 对含有 105 S. typhi, E. coli, S. aureus, L. mono及其混合物的样品进行了测试。测试的 LFA 条带的检测结果如图 4a 所示。图 4b 和 c 分别显示了从六个 LFA 条带的 T1 线和 T2 线测量的 SERS 信号。两条测试线上的DTNB和MBA信号的变化根据样品中存在的不同细菌呈现出开/关模式。此外，从比色和 SERS 信号来看，测试区域上的四种病原体之间不存在交叉反应，表明所使用的抗体具有良好的选择性，并且纳米贴纸在试纸条上没有非特异性吸附。此外，从 LFA 条带拍摄的 SERS 图像证实了许多细菌-GO@Au/Ag 复合物固定在阳性样品测试线的纤维孔上（图 4d-g）。同时，空白对照的同一区域没有 GO@Au/Ag 纳米贴纸（图 4h）。这些结果进一步验证了纳米贴纸特异性而紧密地结合在目标细菌表面，在NC膜上形成具有优异流动性的细菌-GO@Au/Ag复合物，并且可以被特定的抗体负载测试线有效捕获。此外，从相应的 T1/T2 线测量的 DTNB 和 MBA 信号可用于四种不同细菌的多重和定量分析。为了进一步提高 LFA 的性能，对关键参数包括运行缓冲液的组成（图 4i）、抗体涂层浓度（图 4j-k）进行了优化。
图 5. (a) 基于 GO@Au/Ag 的 SERS-LFA 的照片和相应的 SERS 映射图像，用于同时检测 T2 线上的伤寒杆菌和大肠杆菌，以及 T1 线上的金黄色葡萄球菌和单孢杆菌线。 (b) 基于 AuNP 的 LFA 方法对四种目标细菌的检测结果。 (c) T2 线和 (f) T 线的平均 SERS 光谱。 (d) S. typhi、(e) E. coli、(g) S. aureus 和 (h) L. mono 的相应校准曲线。
为了评估基于纳米贴纸的 SERS-LFA 对细菌的多重检测的性能，我们通过检测一系列含有不同浓度的混合细菌样本来验证所提出的检测方法。随着混合细菌浓度的降低，GO@Au/Ag 的颜色强度和测试线的整个 SERS 强度逐渐消失。其分析性能如图5所示。结果表明所提出的 SERS 测定与平板计数方法一样准确可靠，但可以将测试时间缩短至 20 分钟。与普通的 AuNP-LFA 相比，基于纳米贴纸的 LFA 对细菌检测的灵敏度可以提高 500 倍。
总之，本文开发了一种基于 GO@Au/Ag 纳米贴纸的 SERS-LFA 生物传感器，用于超灵敏的多路检测病原体。由于其柔韧性和膜状结构，免疫纳米贴纸可以牢固地包裹在目标细菌上，可以提高病原体-标签复合物在 NC 膜上的流动性，从而克服了细菌大小对 LFA 的影响。利用两个SERS分子可以在两条检测线上同时检测四种不同的病原体，从而有效缩短SERS-LFA的信号读取时间，进一步提高现有LFA技术的复用能力。所提出的生物传感器可以快速同时检测四种重要的细菌。此外，基于纳米贴纸的 SERS-LFA 与标准板计数方法一样准确，并且比基于 AuNP 的比色LFA灵敏500倍。