Weekly Seminar
题目: Alkaline phosphatase-triggered dual-signal immunoassay for colorimetric
and electrochemical detection of zearalenone in cornmeal
Journal:Sensors and Actuators: B. Chemical
IF:7.46
Original link:http//doi:10.1016/j.snb.2022.131525
汇报人: 于阁阁 21级硕士
建立了一种由碱性磷酸酶(ALP)触发的双信号免疫分析方法来检测玉米粉中的玉米赤霉烯酮(ZEN)。样品中固定化的ZEN-牛血清白蛋白和游离的ZEN与抗ZEN单克隆抗体(McAb)竞争性结合。然后，ALP标记的山羊抗小鼠IgG与McAb结合。ALP催化抗坏血酸2-磷酸生成L-抗坏血酸（AA)。AA将铁氰化钾转化为亚铁氰化钾，与铁离子(III)反应，促进普鲁士蓝纳米颗粒(PBNPs)的形成。因此，该溶液出现了多色的变化。同时，PBNPs在700nm处有最大吸收峰。它可以用紫外-可见光谱仪进行监测。K3[Fe(CN)6]作为一种电子转移介质，随着PBNPs的形成而逐渐被消耗。因此，电化学检测也被用于检测ZEN。在最佳条件下，ZEN浓度的对数与实验结果呈良好的线性关系。
玉米赤霉烯酮(ZEN)广泛存在于玉米、小麦等谷物中。此外，ZEN具有致癌作用，并可引起雌激素样反应。天然颗粒中ZEN含量较低，但在适当的温度和湿度下会增加。ZEN具有热稳定性，普通加热方法不能降低其毒性。
多色检测弥补了单比色法的不足，它更容易识别，可直接读取，适合现场检测。随着电化学传感技术的快速发展，电化学检测仪器已经变得更加智能、小型化和便携式。比色传感和电化学传感的结合往往更明智和便携。
1. 实验原理图
原理图：对ZEN进行比色和电化学检测的双信号免疫分析法示意图
2. 双信号免疫分析法的可行性
图1A所示，AA2P和Fe3+形成了一个橙黄色的AA2P-Fe3+配合物，最大吸收峰在456nm处(图1A，曲线f)。K3[Fe(CN)6]溶液呈浅黄色，最大吸收峰在424nm处（图1A，曲线c）。同时，所有含有K3[Fe(CN)6]溶液在424nm处均有相同的吸收峰（图1a，曲线c、e、g、h）。结果表明，在424nm处的吸收峰与K3[Fe(CN)6]有关。当ALP缺乏时，在424nm处只有一个最大的吸收峰(图1a，曲线g)。在700nm处出现了一个吸收峰(图1a，曲线h)，这与PBNPs的产生有关。
如图1B所示，当K3[Fe(CN)6]不存在时，不存在电化学反应（图1B，曲线a、b、d、f、i）。当K3[Fe(CN)6]存在时，出现DPV峰值电流（图1B，曲线c、e、g、h）。此外，当反应体系中存在ALP时，产生PBNPs，消耗K3[Fe(CN)6]，导致DPV峰值电流降低(图1b，曲线h)。相反，当ALP不存在时，DPV峰值电流没有变化(图1b，曲线g)。结果表明，ALP诱导了PBNPs的形成降低DPV峰值电流。
图1：(A) 紫外-可见吸收光谱。(B) 电化学DPV电流，(a) Tris-HCl+NaAc-HAc缓冲液，(b) AA2P，(c) K3[Fe(CN)6]，(d)氯化铁，(e) AA2P+K3[Fe(CN)6]，(f) AA2P+氯化铁，(g) AA2P+K3[Fe(CN)6]+氯化铁，(h) AA2P+K3[Fe(CN)6]+氯化铁+ALP-IgG，(i) 0.07MPBS。插入的(A)图像表示对应的颜色。插入的(B)图像表示表示含(h) /不含(g) ALP-IgG的DPV峰值电流。
如图2A所示，随着ALP-IgG浓度的增加(图2A，a-g分别对应0-100ng/mL)，700nm处的吸光度增加，424nm处的吸光度降低。同时，电化学DPV峰值电流减小(图2b)。424nm处的吸收峰变化小于700nm处的吸收峰变化，因此选择700nm处的吸收峰进行定量分析。
图2：不同水平的ALP-Igg混合溶液的(A)紫外-可见吸收光谱和(B)DPV峰电流。700nm处的(C)吸光度和0.24V处的(D)DPV峰值电流与ALP-IgG浓度的校准图。ALP-IgG的浓度(从“a”到“g”)分别为0、125、200、250、500、750和1000ng/mL。
3. 校准曲线和灵敏度
结果表明，在一定浓度范围内，吸光度或电流的变化与Zen浓度的对数呈线性关系。根据校准曲线法计算检测限(LOD)。计算公式为LOD=3δ/s，其中δ为空白响应(n=20)的标准差，s表示线性拟合曲线的斜率。比色法的检出限为0.04 ng/m L，检测范围为0.2~0.8 ng/m L。电化学法的检出限为0.08ng/m L，检测范围为0.125~0.5 ng/m L。
4. 应用研究
以玉米粉样品为例，新开发的双信号免疫分析和商品化的ELISA试剂盒在所有样本中均未检测到ZEN。双信号免疫法和商品化试剂盒的平均回收率均在80-120%之间。相对标准偏差均小于10%。
根据K3[Fe(CN)6]在多色形成和电子转移中的重要性，可以用比色法和电化学法对Zen进行定量分析。新提出的双信号免疫分析方法的LOD等于或低于已报道的ZEN检测方法。此外，该策略还具有选择性高、操作简单、便于直观判断等优点。