Weekly Seminar
题目：纳米空穴增强纳米材料与细菌之间的电子传输作为纳米生物相互作用的概念
IF：14.919
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-020-20547-9
汇报人：张雅婕 2021级硕士
生物被膜导致细菌感染和耐药性，对全球人类健康构成严重威胁。抗菌纳米材料已经引起了相当大的关注，但对生物膜的抑制仍然是一个重大挑战。在此，我们提出了纳米空穴增强的电子传输(NBET)抗生物膜的概念。与已知的抗菌机制(如产生活性氧和破坏细胞膜)不同，具有原子空位的纳米孔和生物膜分别作为电子供体和受体，从而提高纳米材料和生物膜之间的高电子传输能力。电子传输有效地破坏了生物膜的关键成分(蛋白质、细胞间附着的多糖和胞外DNA)，纳米孔也显著下调了与生物膜形成相关的基因的表达。抗感染能力在体外(人类细胞)和体内(大鼠眼部和小鼠肠道感染模型)都得到了彻底的验证，纳米孔启用的纳米材料被发现具有高度的生物相容性。重要的是，与典型的抗生素相比，纳米材料是非抗药性的，因此在各种应用中显示出很高的潜力。作为一个原则证明，这些发现为NBET在治疗病原性细菌感染和抗生素耐药性方面的使用提供了希望。
过度使用抗生素引起的细菌耐药性造成的危害比癌症更严重。天然抗菌剂化学性质不稳定，抗菌效果有限，且表现出明显的抗药性。抗菌纳米材料成为天然抗菌剂的替代，但是附着在生物膜细胞表面的胞外聚合物(EPSS)会将纳米材料或药物从生物膜中截断，降低其抗菌或抗感染效果。所以迫切需要开发具有良好生物相容性和非耐药性的高效抗菌材料来破坏EPSS或生物膜。纳米孔可以很容易地在二维纳米材料中制造，而且与没有纳米空穴的纳米材料相比，由于存在空位，富纳米空穴的纳米材料呈现出独特的光催化性能。
在这项工作中，纳米孔被引入到二维过渡金属二硫化物(MoS2)纳米片上，以抑制金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物膜的生长和感染。
富含纳米孔的MoS2的纳米片的制备以及所提出的抗生物膜和抗感染机制示意图如下：
NF-MoS2：纳米无孔MoS2 NR-MoS2纳米孔富集MoS2 Edna:胞外DNA PIA:胞间粘附素。
1、单层MoS2中含原子空位的纳米空穴形成的表征
没有明显缺陷或空洞的纳米MoS2(NF-MoS2)平均厚度为1.13±0.59 nm，纳米片结构均匀(图2a)。在富含纳米孔的MoS2(NR-MoS2)中，通过·OH的轻而易举的攻击形成了许多纳米孔(图2A，用蓝色箭头表示)。Brunauer-Emmett-Teller(BET)比表面积分析表明，纳米孔的平均孔径为~40 nm；因此，NR-MoS2纳米片是一种介孔纳米材料(图2B)。此外，高分辨电子显微镜(HR-TEM)图像显示，纳米空穴可以描述为Mo和S(VxMo+Ys，图2C)的原子空位。拉曼光谱证实了NR-MoS2中纳米孔的形成(图2D)。进一步利用正电子湮没寿命谱(PALS)来了解纳米孔的含量(图2E和表1)。在NF-MoS2和NR-MoS2中，Mo与S的比例分别为1：2.2和1：2.9。X射线光电子能谱(XPS)结果解释了Mo/S化学计量比的增加和纳米空穴的形成。
图2. 单层MoS2中含原子空位的纳米空穴形成的表征 a) NF-MoS2和NR-MoS2的典型原子力显微镜(AFM)观察 b) NF-MoS2和NR-MoS2的孔径分布 c) 具有代表性的Nr-MoS2的高分辨电子显微镜成像和Mo、S空位的模拟 d)三维拉曼光谱 e)正电子湮没寿命谱(PALS)图样。
2、纳米空穴增强电子传递对生物膜的抑制作用
NR-MoS2的亲和力响应为14.71nM，是原始MoS2(NF-MoS2，图3A)的11.44nM的1.3倍，这表明在NM(10−9)水平上具有高亲和力。傅立叶变换红外光谱和二维傅立叶变换红外相关光谱分析也证实了COO−对称伸缩是NR-MoS2(图4B)中的目标基团。
图3.纳米空穴增强的电子传输对生物膜的抑制a)用表面等离子体共振法测量生物膜和MoS2纳米片之间的亲和力。NF-MoS2和NR-MoS2的线性扫描伏安法(LSV)曲线(b)和相应的Tafel斜率(c)。d)NF-MoS2和NR-MoS2纳米片的循环伏安曲线。e)NF-MoS2和NR-MoS2的E-Nyquist图。f)NF-MoS2和NR-MoS2的Mott-Schottky图。g)阻断电子传递对生物膜形成的影响。
3、通过电子传输靶向生物膜上的关键活性部位
电子传递后，生物膜中的N-H和C-H基团增加，而C-O基团减少(图4C)。处理组和对照组之间的酰胺I键发生了显著的变化，表明电子传递主要攻击生物膜上的蛋白质。与对照相比，随着MoS2纳米片的加入，生物膜在204 nm处的紫外可见吸收峰强度逐渐增加，这表明电子传递减少了蛋白质骨架的螺旋和展开(图4D)。作为电子传递靶向的关键活性成分PIA和eDNA的含量都被NR-MoS2纳米片显著降低(图4F，g)，结果与2D-FTIR-COS和FTIR分析一致。
图4.通过电子传输瞄准生物膜上的关键活性部位。a)MoS2纳米片处理的生物膜红外光谱的同步和异步2D-FTIR-COS图谱。b)二硫化钼纳米片靶向生物膜的潜在官能团。c)未处理的生物膜(对照)、生物膜+NF-MoS2和生物膜+NR-MoS2的C-FTIR光谱。 d)NF-MoS2和NR-MoS2处理的生物膜的三维紫外可见吸收。f)NF-MoS2和NR-MoS2处理的生物膜的紫外差示光谱。g)生物膜的PIA含量。生物膜的EDNA含量
4、生理条件下电子传递抑制生物膜形成及相关基因表达
在没有NR-MoS2的培养过程中，大多数细菌生活在生物膜中，氯化钠、葡萄糖和乙醇促进了生物膜的形成(图5A，b)。NR-MoS2显著降低了PIA生物量，即使在氯化钠、葡萄糖和乙醇存在下也是如此(图5C)。相反，NF-MoS2对生物被膜的抑制作用有限，并没有减少PIA的含量。即使在氯化钠、葡萄糖和乙醇存在的情况下，纳米孔也抑制了与生物膜形成相关的基因的表达(图5D)。
图5.在生理条件下，电子传递抑制生物膜的形成和相关基因的表达。a)一个具有代表性的生物膜三维重建共聚焦图像。其长度和宽度均为800 nm。b)根据生物膜的三维重建共聚焦图像计算出荧光强度。生物膜用SYTO9和PI双重染色。c)生物膜的PIA含量。d)三维示意图显示了在生理条件下NR-MoS2对生物膜形成的抑制作用。
5、抑制致病细菌对人体细胞的黏附和侵袭。
NR-MoS2显著抑制金黄色葡萄球菌对Caco-2细胞的黏附和侵袭(图6A)。Caspase-3是一种重要的细胞凋亡效应酶。金黄色葡萄球菌显著诱导Caco-2细胞凋亡，但NR-MoS2降低caspase-3活性，有效缓解金黄色葡萄球菌诱导的肠上皮细胞凋亡(图6B)。此外，NR-MoS2显著减轻了金黄色葡萄球菌引起的细胞外乳酸脱氢酶(LDH)泄漏的程度，这是膜损伤的一个指标(图6C)。与对照组相比，生物被膜诱导剂诱导的NO释放增加了~1.2-1.7倍，而NR-MoS2处理的细胞释放的NO仅为对照组的三分之一(图6D)。上述结果表明，纳米孔可以抑制病原菌对人体细胞的黏附和侵袭。
图6. NR-MoS2抑制金黄色葡萄球菌对人体细胞的黏附和侵袭。a)与金黄色葡萄球菌共培养的Caco-2细胞。b)Caspase-3活性。c)乳酸脱氢酶(LDH)释放。d)没有释放。e)示意图显示了NR-MoS2对金黄色葡萄球菌黏附和侵袭人体细胞的抑制作用。
6、在动物肠道和眼部模型中具有抗感染作用
NR-MoS2对小鼠金黄色葡萄球菌肠道感染的治疗效果是有效的，并显著减少了生物被膜的形成(图7A，b)。经NR-MoS2处理后的CD11c阳性细胞数与对照组接近，这与ELISA法数据一致(图6C)。此外，组织学分析(图7D)表明，NR-MoS2具有良好的生物相容性，体内植入NR-MoS2后未发现明显的组织损伤。感染组表现出严重的眼球肿胀和角膜炎(图7A)。相比之下，NR-MoS2显著促进伤口愈合并减少角膜炎，治疗3天后眼睛状态恢复正常(图7E)。平板集落试验结果证实，用NR-MoS2处理具有有效的抗感染作用(图7F)。用视觉水试验检查角膜的视觉灵敏度和视力的恢复情况。与感染组相比，NR-MoS2处理的大鼠在测试过程中表现出强烈的视觉敏感度和明显的视力改善(图7g-I)。表明NR-MoS2治疗成功地恢复了角膜感染大鼠模型的视觉敏感性和视力。
图7.在肠道和角膜感染模型中评价NR-MoS2的抗感染效果。a)在肠道和角膜感染模型中评价NR-MoS2抗感染作用的示意图。b)金黄色葡萄球菌结肠。c)CD11c免疫组织化学染色分析。d)组织学苏木精伊红(H&E)组织染色分析。e)大鼠在NR-MoS2治疗过程中眼部状态的电子照片。f)从琼脂平板上培养的角膜组织中分离出金黄色葡萄球菌。比例尺=20 mm。g)在视觉水试验中逃避潜伏期。h)在视觉水中进行游泳速度测试。i)目测水试验期间的路径痕迹。
7、与抗生素耐药性相比，不耐药
如图8A所示。抗生素的抗药性是一个严重的全球性问题。比较金黄色葡萄球菌对NR-MoS2和3种临床常用抗生素的耐药率。如图8B所示，金黄色葡萄球菌对三种受试抗生素(环丙沙星、甲氧西林和四环素)迅速产生抗药性，但即使连续20代也没有对NR-MoS2产生抗药性。主要的多药转运体之一是QacA多药外排泵，它由qacA基因编码(图9A)。在QacA系统中，蛋白质的二级结构单元主要是“α-螺旋”构象，偶尔也是“3-螺旋”构象(图9B)。与NF-MoS2体系相比，NR-MoS2体系中的“β桥”消失(图9C，d)。当加入NR-MoS2后，QacA中不再出现β-桥，而是以“5-螺旋”构象出现(图9E)。QacA的这种异常结构将导致细菌耐药性的降低，并进一步支持增强的非耐药性。
图8.体内超强抗生物被膜形成及耐药性分析。a)体内超级抗生物被膜形成示意图。b)在使用亚最小剂量抑菌剂的连续传代过程中，耐药金黄色葡萄球菌细胞的发展。c)连续传代20代后，结晶紫染色测定生物膜活力。d)NR-MoS2处理后金黄色葡萄球菌耐药相关蛋白的蛋白-蛋白相互作用分析。
图9.多药外排泵QacA的结构变化。a)膜外排蛋白QacA的晶体结构。b-d)QacA和MoS2纳米片之间结合模式的B-D MD模拟。e)NF-MoS2和NR-MoS2处理后QacA二级结构的变化。
本研究提出了一种最新的概念和机制，其中NBET增强了纳米材料的抗生物膜和抗感染性能。具有原子空位的纳米空穴的电子传输增强了与生物膜的氧化还原反应，改变了生物膜的关键成分和相关基因的表达，从而在体外和体内抑制了病原菌。与典型的抗生素相比，NBET具有制备简单、生物相容性好、无耐药性等优点，因此也可用于其他纳米材料和抗菌药物的设计。