题目：高尔夫形Bi2Se3微粒基免疫层析条带超灵敏检测啶虫脒
期刊：《Journal of Hazardous Materials》
IF：10.59
原文链接：10.1016/j.jhazmat.2022.128810
汇报人：王悦琦 2021级硕士
本文构建了一种基于高尔夫形状的Bi2Se3微粒免疫层析带(BSMPs-ICS)，用于乙酰氨基物(ATM)的超灵敏检测。该新型免疫信号标签具有优异的亮度、优异的生物相容性和与ATM的高亲和力，不仅具有显著的亲和力标记效率，也显著提高了检测灵敏度。优化后，检测的极限(LOD)是8.780pg/mL，线性关系范围在0.010-6.000ng/mL，比传统的金纳米颗粒-ICS低62倍(0.545ng/mL)，BSMPs-ICS应用于苹果和番茄样品中回收率约为83.823-99.223%。
乙酰胺(ATM)属于新烟碱类的一种广谱杀菌剂。环境中过量的ATM对人类健康构成巨大威胁有致突变、致癌和致畸的风险。常见的免疫学载体依赖于复杂的制备和化学活化过程，可能会破坏抗体的生物相容性，从而影响检测的灵敏度。近年来，铋/硒金属衍生的新型材料由于其优异的热电和良好的光热转换，已广泛应用于抗肿瘤治疗、立体定向体放疗和高性能超电容器。受上述载体优异性能的启发，制备了一种简便高效的高尔夫球形BSMPS微粒用于ATM的检测。
本试验检测的主要原理图如下：
(A) SMPs和BSMPs-mAb探针的合成过程示意图，(B)BSMPs-ICS的制备，(C)用于ATM传感的BSMPs-ICS的原理示意图
1、BSMPs的构建和表征
采用扫描电子显微镜(SEM)和透射电镜(TEM)对BSMPs的微观结构和形貌进行了表征。如图1A和1B所示，BSMPs表现出相对均匀的球形形态，平均直径为1.307±0.244μm(图1C)。BSMPs的X射线衍射图谱如图1D所示，其中图1e和图1f分别是BSMPs高分辨率的Bi4f和Se3d光谱，说明了BSMPs中Bi元素以Bi3+，Se元素以Se2-的形式存在。以上结果清楚地证明了BSMPs的成功合成。
图1. BSMPs的表征 (A)SEM图像 (B)TEM图像 (C)粒径分布直方图 (D)BSMPs的XRD谱 (E)BSMPs的高分辨率的Bi4f和(F)Se3d光谱
2、BSMPs-mAb探针的表征
图2 评估BSMPs-mAb探针 (A)BSMPs和BSMPs-mAb的ζ-电位 (B)BSMPs、BSMPs-mAb和mAb的FT-IR光谱 (C)BSMPs、BSMPs-mAb和mAb的紫外-可见光谱 (D)用ELISA检测OD450与抗atm单抗浓度的标准曲线
用BSMPs修饰了抗ATM单抗。其中BSMPs和BSMPs-mAb的ζ-电位如图2A所示，其证实了BSMPs与抗ATM单抗之间存在静电相互作用。BSMPs、BSMPs-mAb和单抗的FT-IR光谱扫描如图2B所示，与BSMPs结合后，在38600px-1处的蛋白质特征峰移至38325px-1，这可能是由于BSMPs与单抗之间的静电相互作用或范德瓦尔斯力有关。BSMPs、BSMPs-mAb和mAb的紫外-可见光谱如图2C所示，与纯BSMPs相比，BSMPs-mAb在276nm处出现了一个新的吸收峰。图2D表明，在单克隆抗体浓度为10.000μg/mL时，BSMPs具有良好的标记效率为97.380%，偶联单克隆抗体数量为3.910×1013分子/mL。以上结果表明BSMPs与抗ATM单抗成功结合。
3、实验条件的优化
图3 关键实验参数的优化结果 (A)抗ATM单抗浓度 (B)T线上抗Mag浓度 (C)BSMPs浓度(D)BSMPs-mAb探针体积
构建了BSMPs-ICS方法。以“T/C值”和“抑制率”作为指标，系统优化了BSMPs-ICS的几个关键实验条件，包括抗ATM单抗的数量、T线上ATMag的数量、BSMPs的浓度和BSMPs-mAb探针的体积。抑制率采用(1-B2/B1)×100%计算(B2为添加样品的T/C值，B1为阴性样品的T/C值)。
抗ATM单抗的数量的优化如图3A所示，随着抗ATM单抗增加，T/C值逐渐加深，当抗ATM单抗量为4μg时，抑制率达到最大值随后降低。这种现象可能是由于过量抗体的非特异性吸附引起的。图3B-D分别表明，T线上的最佳ATMag量为0.7μL/cm，该传感器的BS MPs的最佳浓度为1.0mg/mL，BSMPs-mAb最佳探针体积为4μL。
4、BSMP-ICS的分析性能
图4 BSMPs-ICS和AuNPs-ICS的检测性能 (A)BSMPs(0-11依次代表0.000、0.010、0.020、0.045、0.090、0.180、0.375、0.750、1.500、3.000、6.000和120.000ng/mL的ATM)和(B)AuNPs-ICS(0-10依次表示0.000、0.1800、0.375、0.750、1.500、30.500、6.000、12.500、25.000、50.000和100.000ng/m L的ATM) (C)BSMPs-ICS和(D)AuNPs-ICS检测的校准曲线。(E)BSMPs-ICS和(F)AuNPs-ICS的特异性结果。
为了分析方法的灵敏度和定量检测范围，通过检测不同浓度的ATM评价了BSMPs-ICS的分析性能。图4A所示，在没有ATM的情况下，T线上显示了一个清晰的黑色条带。对于阳性样品，随着ATM浓度的增加，T线的颜色亮度逐渐变浅。ATM检测的BSMPs-ICS的目视检查限和截止值分别为0.020ng/mL和6.000ng/mL，AuNPs-ICS的截止值分别为0.375ng/mL和50.000ng/mL。
图4C和4D中图像的定量分析可以通过使用便携式条带阅读器来实现。BSMPs-ICS的校准曲线良好，信号强度与Lg[ATM浓度]之间的相关系数为0.981。回归方程可拟合为Y=−0.266X+0.268，线性关系范围为0.010~6.000ng/mL。此外，该传感器的LOD为8.780pg/mL， BSMPs-ICS比AuNPs-ICS的检测限约低62倍。
为了确定BSMPs-ICS的特异性识别和抗干扰能力，通过BSMP-ICS检测了ATM的几种典型的农药类似物ATM、CBD、AP、CA、CBZ、TMX、PAM、IMD和TED，结果如图4E所示，除ATM外，干扰物质的所有T线均没有显著变化。随后通过AuNPs-ICS和ELISA验证了上述结果(图4F)，结果表明该分析方法具有良好的特异性。
5、实际样品分析
图5 采用BSMPs法对(A和C)苹果和(B和D)番茄样品中ATM的检测结果(0-11依次表示ATM的0.000、0.010、0.020、0.045、0.090、0.180、0.375、0.750、1.500、1.500、3.000、6.000和12.000ng/mL)
将不同浓度的ATM加入到上述样品中并进行分析。如图5A和5B所示，随着ATM浓度的升高，黑色在T线上逐渐褪色。苹果和番茄样品中ATM的截止值均为6.000ng/mL，ATM的目视检测限均为0.020ng/mL(图5C和5D)。AuNPs-ICS对苹果和番茄样品ATM检测的临界值和目测限分别为0.375ng/mL和50.000ng/mL。这些结果表明，该ATM检测传感在复杂的食物基质中具有更好的潜力。
本文构建了一种基于高尔夫形状的Bi2Se3微粒免疫层析带(BSMPs-ICS)，用于乙酰氨基物(ATM)的超灵敏检测。所提出的BSMPs-ICS具有优良的优点：（1）它具有优越的信号强度和单克隆抗体耦合效率。（2）BSMPs可以通过轻松离心吸附单克隆抗体，忽略交联剂的曲折激活。（3）BSMPs-ICS显示出一个令人满意的Ka值（≈107）来维持抗体活性。（4）BSMPs首次作为监控ATM的新型类型标签，扩展了BSMPs的应用范围。（5）BSMPs-ICS比AuNPs-ICS显示出更好的成本效益和敏感性。因此，所提出的BSMPs-ICS可以为有害分析物中危险物质的高灵敏度检测和环境监测提供一个很有前途的平台。
题目：清除促炎因子治疗严重腹部创伤的可注射抗生素水凝胶
期刊：Advanced Functional Materials
IF：18.81
原文链接： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adfm.202111698
汇报人：张祖旺 2021级硕士
腹部受伤后的细菌感染和过度炎症可导致危及生命的并发症，导致多器官衰竭和死亡。因此，使用含有抗生素的阳离子水凝胶伤口敷料从伤口部位去除细菌和促炎因子（主要带负电荷）是治疗严重腹部创伤的一种有前途的治疗方法。在这里，通过席夫碱反应开发了一种可注射的自愈水凝胶，由形成凝胶的糖胺聚糖氧化硫酸软骨素 (OCS)、阳离子聚乙烯亚胺 (PEI) 和抗生素妥布霉素 (Tob) 组成。与缺乏 PEI 或 Tob 的水凝胶相比，只有 Tob/PEI/OCS 水凝胶对带负电的促炎因子（包括无细胞 DNA、脂多糖、TNF-α 和高迁移率组框 1 蛋白）表现出较大的结合能力，以及体外细菌种群大量减少。在严重腹部创伤的小鼠模型中，Tob/PEI/OCS 水凝胶表现出良好的生物降解性和生物安全性，减少了局部和全身炎症和感染，并防止了多器官衰竭，从而实现了 100% 的存活率。因此，这种水凝胶敷料是一种很有前途的生物材料，可用于预防严重腹部创伤后的并发症和改善预后。
腹部创伤最常见的原因是刺伤或枪击穿透腹壁，或由道路交通事故或从高处坠落造成的钝性创伤。腹膜污染、内脏损伤和长时间出血使患者易患生命危险。威胁性并发症。 组织损伤、病原体感染和失调的炎症以复杂、非线性的方式导致腹部创伤。 目前通过手术、液体复苏和控制感染来处理腹部创伤的策略对于严重病例来说是不够的。迫切需要快速减轻炎症和感染以预防严重腹部创伤后并发症的新方法。该课题组希夫碱反应合成了由PEI、氨基糖苷类抗生素妥布霉素（Tob）和凝胶形成的糖胺聚糖氧化硫酸软骨素（OCS）组成的阳离子水凝胶，用于腹部创伤后的治疗。
水凝胶合成和作为伤口敷料应用于治疗腹部创伤的示意图如下：
图1. A) 水凝胶的合成过程。 B) 作为治疗腹部创伤的伤口敷料，阳离子水凝胶可清除阴离子促炎分子，通过促进巨噬细胞从促炎表型 (M1) 转化为组织修复表型 (M2) 来减少炎症。
1. 水凝胶的表征
在共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和SEM图像(图2A–F)中，水凝胶显示出多孔的内部网络结构，其中Tob/PEI/OCS凝胶由于其更大的氨基丰度和交联密度而拥有最致密的网络。在1%应变和1 Hz下，所有水凝胶的储能模量(G’)都超过了损耗模量(G”)，表明成功形成了稳定的粘弹性水凝胶(图2G)。随着PEI的引入，储能模量和损耗模量增加。PEI具有较高的胺密度和较小的空间位阻，加入PEI将提高反应效率，从而提高材料的机械性能。当剪切速率从0.01增加到100s–1时，水凝胶粘度急剧下降(图2H)。这种剪切稀化行为有利于这些水凝胶的可注射性。Tob/PEI/OCS水凝胶由于席夫碱的裂解和静电相互作用，表现出pH依赖性降解和释放行为(图2I)。水凝胶具有自愈合能力(图2J)，这归因于席夫碱连接的动态性质:当三个水凝胶块在没有外部刺激的情况下相互接触时，这些块形成单一水凝胶，该水凝胶在拉伸时保持完整。
图2. 阳离子水凝胶的表征。水凝胶的A-C）CLSM图像和D-F）SEM图像，Tob/OCS（A和D）、PEI/OCS（B和E）和Tob/PEI/OCS（C和F）。G） 水凝胶的储能模量（G’）和损耗模量（G’’）。H） 剪切速率为1–100 rad s−1时水凝胶的粘度变化.（I）Tob/OCS和Tob/PEI/OCS水凝胶在pH 5.0或pH 7.4下的Tob释放曲线。J） 通过使三个水凝胶块接触来测试水凝胶的自愈能力；这些区块形成了一个单一的水凝胶，在拉伸时保持完整。
2. 水凝胶清除促炎分子和细菌
阳离子水凝胶不仅清除阴离子细胞因子、LPS、CpG，还清除阴离子大肠杆菌(图3)。
使用革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌来分析这些水凝胶的抗菌性能，阳离子水凝胶杀死所有细菌(图3E，F)。进行细菌生存力和克隆实验来评估这些水凝胶在溶液中的抗菌性能。与不含抗生素的PEI/OCS凝胶相比，这些Tob/OCS和Tob/PEI/OCS凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出更强的抗菌活性(图3G，H)。
通过测量促炎性cfDNA对TLR4和TLR9激活的影响，以及促炎性cfDNA和LPS刺激的巨噬细胞对TNF-α分泌的影响，研究了水凝胶的抗炎活性。所有水凝胶都减少了CpG ODN诱导的TLR9激活，CpG ODN是腹部创伤时常见的cfDNA（图3J）。 水凝胶还可阻断LPS诱导的TLR4激活（图3K），并减少CpG和LPS刺激的RAW 264.7细胞分泌TNF-α（图3L）。总之，这些结果表明阳离子水凝胶在体外对促炎因子具有保护作用。
图3. 阳离子水凝胶清除促炎分子和细菌。A–D)孵育12小时后,( A) TNF-α、(B) CpG、(C) LPS和(D) HMGB1的水凝胶结合效率。E–F)37℃下孵育2小时后水凝胶的表面抗菌活性。G–H )(G)大肠杆菌和(H)金黄色葡萄球菌在与水凝胶孵育24小时期间的生长曲线。I)水凝胶抗菌96小时的抑制区域热图。
3.体内严重腹部创伤后并发症的保护
盲肠结扎和穿孔(图4A)被用作严重腹部创伤的模型。CLP模型模拟了严重腹部创伤和随后的多菌性腹膜炎的发病机制、程度和进展。尽管13只未处理的小鼠中只有4只存活到168小时(7天)研究终止，但是用Tob/OCS凝胶处理的13只小鼠中有7只存活，用PEI/OCS凝胶处理的13只小鼠中有8只存活，并且用Tob/PEI/OCS凝胶处理的13只小鼠全部存活(图4B)。这些存活结果与基于临床评分的水凝胶的效果一致:Tob/PEI/OCS凝胶治疗组观察到最低评分(图4C)。腹部创伤在手术后 24 小时增加了 TNF-α、IL-6 和 cfDNA 的血清水平，表明全身炎症，而水凝胶减轻了这种全身炎症。 Tob/PEI/OCS 凝胶处理小鼠的血清 TNF-α 和 IL-6 水平低于其他治疗组，这与 Tob/PEI/OCS 凝胶组的较低死亡率一致（图 4D-F）。
图 4. Tob/PEI/OCS 水凝胶部分通过去除循环中的促炎因子来保护小鼠免受严重腹部创伤后的并发症和死亡。 A) 盲肠结扎和穿刺 (CLP) 引起的严重腹部创伤示意图。 B) CLP 后监测小鼠存活 168 小时。 C) CLP 后 168 小时的小鼠临床评分。在 CLP 后 24 小时测定 TNF-α (D)、IL-6 (E) 和 cfDNA (F) 的血清水平。
水凝胶治疗显着改善了心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和结肠的损伤，包括防止坏死、组织破坏和白细胞浸润（图 5A-D）。与器官组织学的这些变化一致，水凝胶逆转了血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、肌酐 (CRE)、肌酸激酶 (CK)（图 5E-G）。总的来说，水凝胶在严重的腹部创伤后表现出显着的保护作用，包括逆转炎症和预防多器官衰竭。
图5. Tob/PEI/OCS水凝胶可预防CLP所致腹部创伤后的多器官衰竭。A） CLP后24小时，采集心脏、肝脏、脾脏、肺、肾和结肠，并用h&E染色。根据既定标准评估相应的肝脏（B）、肾脏（C）和心脏（D）损伤分数。分析血清生化指标ALT（E）、CRE（F）、CK（G）。
4. 体内抗炎和抗菌性能
三种水凝胶都显著降低了腹腔内促炎性cfDNA、TNF-α和IL-6的水平，其中Tob/PEI/OCS凝胶表现出最大的清除效果，包括去除>70%的cfDNA（图6A-C）。由于腹腔巨噬细胞在腹部创伤进展中起着关键作用，作者研究了水凝胶治疗对这些巨噬细胞M1/M2极化的影响。流式细胞术分析一致证实，与模型组相比，阳离子凝胶治疗后M2巨噬细胞的百分比显著升高（图6D、E），而M1表型降低。未经治疗的CLP诱导的腹部创伤与腹腔巨噬细胞中M1极化标记物TNF-α和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的增加以及M2极化标记物Arg-1的减少有关（图6F-H）。相比之下，Tob/PEI/OCS凝胶治疗显著逆转了模型组的mRNA表达趋势。总的来说，使用Tob/PEI/OCS水凝胶治疗后，基于这些标记物的表达，极化向M2表型转变，表明通过调节腹腔巨噬细胞具有抗炎活性。
图6。严重腹部创伤后，Tob/PEI/OCS水凝胶将腹腔巨噬细胞极化从M1转移到M2。CLP后24小时腹腔灌洗液中A）cfDNA、B）TNF-α和C）IL-6的腹膜水平。在CLP后24小时收集腹腔巨噬细胞，并通过流式细胞术分析评估腹腔液中D）M1和E）M2巨噬细胞的百分比。分析F）TNF-α、G）iNOS和H）Arg-1的基因表达。
本文开发了一种可注射水凝胶作为伤口敷料，以防止因严重腹部创伤后炎症和感染失调而引起的并发症。阳离子水凝胶清除阴离子促炎分子（DAMP和PAMP）和细菌，并提供抗生素。交联水凝胶的柔性部分允许粘弹性和自愈合，通过分离水凝胶块形成单个完整水凝胶的能力证明了这一点，该水凝胶能够承受拉伸。该水凝胶在体内外均具有抗炎和抗菌活性，并在盲肠结扎和穿刺严重腹部创伤小鼠模型中防止多器官损伤和死亡。单次给药水凝胶可获得100%的存活率，以及良好的生物降解性和生物安全性。
题目：NIR-II荧光横向流动免疫分析平台灵敏、同时检测多指标肺癌生物标志物
期刊：《Chemical Engineering Journal》
IF：13.27
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2022.135204
汇报人：吴昊芬 2021级硕士
以高灵敏度、即时分析的方式同时检测多种癌症血清生物标志物，对于简单进行癌症的早期筛查具有重要意义。本项工作通过两种策略提高了侧流免疫分析(LFIA)平台的灵敏度：一、使用 NIR-II 发射硫化铅量子点 (PbS QD) 代替常见的可见区域荧光团，以减少来自样品基质的背景干扰。二、大量疏水性 PbS 量子点通过三维分布方式集中组装在单个树枝状支架内，以增强单个胶体标记的荧光强度。采用多条检测线的LFIA试纸，实现癌胚抗原（CEA）、细胞角蛋白19片段（Cyfra21-1）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）的同时诊断。
多目标 LFIA 可在 12 分钟内完成，并通过便携式 NIR-II 条形扫描仪获得精确的定量结果。分析数据表明 CEA、Cyfra21-1和 NES 的线性检测范围分别为0.11-100 ng/mL、0.18-100 ng/mL 和0.28-100 ng/mL，检测限分别为0.11、0.18和0.28 ng/mL。多靶点 LFIA 揭示了三种特异性抗体偶联标记物与人血清中非特异性癌症生物标志物和干扰蛋白的轻微交叉反应。在肺癌患者和健康人的真实血清中，三种生物标志物的联合检测灵敏度提高了92.7%，显著高于任何单独的生物标志物检测，特异性达到92.0%。具有高灵敏度和特异性的多靶点 LFIA 平台对于多种癌症生物标志物的即时诊断和同时诊断具有重要意义。
癌症每年导致数百万人死亡，被认为是世界上最致命的疾病之一。癌症生物标志物的简便灵敏诊断对癌症的早期筛查和治疗具有重要意义。侧流免疫分析 (LFIA) 被认为是最有前途的体外临床诊断即时 (POC) 平台之一。考虑到传统胶体金比色法 LFIA 灵敏度低和精确定量能力有限的缺点，基于荧光的 LFIA 大大提高了信号对比度和检测灵敏度。近红外（NIR）荧光材料具有超过700 nm至1700 nm的长发射波长，已成功应用于深层组织荧光成像和生物传感，有效屏蔽来自生物基质的强背景荧光干扰。
本项研究建立了多个疏水性 PbS 量子点三维掺入单个亲水性胶体，以及多种癌症生物标志物的敏感 NIR-II 光谱窗口 LFIA 的表面功能化。在密集的二氧化硅壳生长和连续引入氨基和羧基后，NIR 荧光胶体 (NFC) 与癌胚抗原 (CEA)、细胞角蛋白 19 片段 (Cyfra21-1) 或神经元特异性烯醇化酶 (NSE) 的抗体结合，通过简便的程序和便携式终端设备对真实血清样本中的肺癌生物标志物进行灵敏和组合检测。
1.材料表征
图1 iNFC的合成过程
图2 PbS QDs (a, e)、dSi模板(b, f)、dSi/PbS组件(c, g)和NFC纳米球(d, h)的TEM图像；NFC纳米球的STEM图像(i1)和EDS元素(Si, O, Pb, S)映射图像(i2-i5)
图3 dSi模板(a, d)、dSi/PbS组件(b, e)和NFC纳米球(c, f)的SEM图像
TEM 图像(图2a和2e)显示，油酸包覆的 PbS 量子点呈均匀球形。树枝状二氧化硅胶体(dSi)表现出中心-径向多孔形态，平胶体尺寸220 nm(图2b和2f)。SEM 图像(图3a和3d)表明，dSi 在二氧化硅胶体上显示了数十纳米的大孔隙，这有利于纳米颗粒的均匀掺入。SEM 图像(图3b和e)显示，与原始模板相比，由于孔隙壁上的量子点占据，孔隙尺寸显著减小。TEM 和 SEM图像(图2d,h和图3c,f) 可以看出，形成的近红外荧光纳米胶体 (NFC) 具有20 nm 的明显二氧化硅涂层和近似球形的无孔形貌。NFC 的 STEM 和 EDS 元素映射显示嵌入的量子点 (Pb, S) 均匀分布在整个树枝状多孔模板中，硅壳 (Si, O) 包裹在整个组装体周围 (图2i1-i5)。
图4 (a)氮吸附解吸等温线和纳米结构的BJH孔径分布；(b) PbS量子点与纳米结构的水接触角；(c) PbS量子点和NFC纳米球的XRD谱图（根JCPDS#5-0592）；(d) PbS量子点和纳米结构的FTIR光谱（垂直线表示PbS的衍射）；(e, f) dSi模板及其衍生物纳米结构在水中的水动力直径分布(e)和zeta电位分布(f) （误差条表示三个独立实验的标准差）
从 BJH 胶体的孔径分布(图4a)可以看出，随着合成过程的进行孔隙逐渐减小，经过广泛的二氧化硅生长后，NFC 中的孔隙完全消失。复合材料的水接触角（WCA）表明它们在合成过程中的表面化学变化（图4b）。XRD 图(图4c)显示了 PbS 量子点的(111)、(200)、(220)、(311)、(222)、(400)、(331)、(420)、(422)和(511)面的衍射峰，这些衍射峰可以被指定为 PbS (JCPDS#5 0592)的面心立方衍射峰。NFC 的衍射峰与其组分 QDs 匹配良好，表明植入纳米晶体的结晶度保持良好。图4d红外光谱进一步证实了疏水 PbS 量子点与枝状二氧化硅模板的结合。动态光散射反映了纳米结构在处理过程中的水动力直径 (HD) 和胶体分散状态(图4e)。从 dSi 到 NFC，纳米结构均表现出清晰的 HD 单分布峰，且胶体尺寸逐渐增大。制备的 NFC-COOH 球 ZP 急剧倒置为34.5 mV，表明羧基的成功引入。小的多分散性指数 (PDI) 表明纳米结构在合成过程中具有良好的胶体分散性。与原 NFC-COOH (-34.5 mV)相比，iNFC 的HD略有升高，ZP 显著下降14.6 mV，这与表面偶联抗体和阻断剂有关。
2.材料的荧光性能
图5 (a) PbS QDs上清(上)和PbS QDs组装到dSi- sh模板后在氯仿中重新分散dSi/PbS组件的照片(下)（投料含量从50%到300%）；(b) dSi-SH模板中PbS QDs加载量与PbS QDs馈送量的关系；(c) dSi/PbS组装体的荧光强度与量子点加载量的关系（插图显示分散在氯仿中不同负载含量的dSi/PbS组件的NIR-II荧光图像）；(d) PbS QD的荧光光谱和纳米结构如所示。插图为PbS、dSi/PbS、dSi/PbS/OTMS、NFC和NFC- cooh的照片(上)和NIR-II荧光图像(下)(分别编号为1-5)；(e) NFC-COOH 水溶液分散体的荧光强度与浓度的关系。插图为 NFC-COOH 水分散体对应的 NIR-II 荧光图像；(f) NIR-II 荧光图像(插图)和 NFC-COOH 水分散体在不同 pH 值下的荧光强度。误差条表示三个独立实验的标准差。
PbS QDs 在硅胶模板中的负载能力如图5a-b所示。量子点加入量的增加形成了一系列的 dSi/PbS，随着加载量增加分散颜色变暗。当进给量为300%时，PbS 量子点在 dSi-SH 中最大加载量为185%，这可能是由于协同驱动组装的效率和通道表面的饱和。加载量对组装体 NIR-II 荧光亮度的影响研究如图5c所示。随着量子点加载量的增加，视觉颜色亮度和分光光度计荧光强度均单调增加，验证了疏水 PbS 量子点注入树突模板后，NIR-II 发射持续增强。与发射波长为1294 nm的原始 PbS 量子点相比，配位驱动组装、有机二氧化硅包覆、密集的二氧化硅壳生长和接枝羧基对量子点单元的荧光光谱特征影响较小(图5d)。与原始 PbS 量子点相比，NFC-COOH 的最大发射波长(1310 nm)出现了轻微的红移。NFC-COOH 的水分散体表现出良好的浓度依赖性的近红外荧光强度，这与近红外图像中的荧光亮度变化相一致(图5e)。荧光强度与 NFC-COOH 浓度之间良好的线性关系保证了纳米标记的准确免疫分析定量能力。此外，水相分散的 NFC-COOH 在 pH 值为4 ~ 11时表现出稳定的荧光，发射强度的变化相对较小，这可能是由于有机硅/致密二氧化硅双层包埋隔离了注入的量子点(图5f)。
3.试纸条的免疫分析性能
图6 (a)利用NFC-LFIA条检测多指标肺癌生物标志物的原理；(b)使用NIR-II光谱区为NFC-LFIA条设置便携式荧光扫描仪；(c) LFIA条的检测线和控制线上荧光信号的代表性扫描曲线。
基于 NFC 的 LFIA 平台由多靶点免疫层析条带和用于定量分析的便携式 NIR-II 荧光条带扫描仪组成(图6)。层析开始时，将含有癌症生物标志物的液体样品滴入样品垫中。在毛细管力作用下，随硝化纤维素膜向吸收垫迁移。结合垫上的抗 CEA、抗 Cyfra21-1或抗 NSE 抗体的 iNFC 标签与相应的抗原结合。形成的免疫复合物流过测试线，并被匹配的捕获抗体固定，以显示 CEA (T1)、Cyfra21-1 (T2)和 NSE (T3)的荧光带，对照线(C)上的二抗捕获多余的 iNFC 标签进行验证(图6a)。捕获的量子点经二色镜反射后，由780 nm激光激发。用1050 nm 长通滤波器过滤 T1、T2、T3和 C 荧光带的NIR-II发射，并由 InGaAs 光电二极管连续检测(图6b)。从扫描曲线中得到 T 线和 C 线下综合面积的比值(ST/SC)，用于生物标志物浓度的定量(图6c)。
图7 (a-d) NFC-LFIA条带NIR-II荧光图像，用于检测CEA (a)、Cyfra21-1 (b)、NSE (c)和结合三个生物标志物(d)；(e-h)不同浓度(1 10:0、0.1、0.3、1、2、5、10、20、50和100 ng mL 1) NFC-LFIA条带在不同浓度CEA (e)、Cyfra21-1 (f)、NSE (g)及组合三个生物标志物(h)的荧光扫描仪扫描曲线；(i-l)荧光 ST/SC 比值与CEA (i)、Cyfra21-1 (j)、NSE (k)及组合三个生物标志物(l)浓度的线性关系（误差条表示三个独立实验的标准差）
如图7a-c所示，条带对单个 CEA (T1)、Cyfra21-1 (T2)或 NSE (T3)分别表现出典型的浓度依赖性 NIR-II 荧光亮度，分别为0、0.1、0.3、1、2、5、10、20、50和100 ng/mL。同时，所有的条带显示单带阳性的视觉结果，标签与其他平行测试线有少量的非特异性交叉。便携式 NIR-II 荧光扫描仪 NFC-LFIA 条带的扫描曲线(图7e g)证实了 T 线峰随着被分析物浓度的增加而升高，与不相关的检测线有轻微的假阳性信号。每个抗原的 ST/SC 比值与抗原浓度呈良好的线性关系，最高可达100 ng/mL。检测等浓度、逐步稀释的三种癌症生物标志物的组合样品溶液时，观察到 T1、T2、T3荧光带的组合变化呈浓度梯度依赖性(图7d)，与多目标检测的组合扫描曲线一致(图7h)。单次检测结果表明，CEA、Cyfra21-1和 NSE 在抗原浓度分别为0.11-100 ng/mL、0.18-100 ng/mL/和0.28-100 ng/mL 时呈良好的线性关系。计算 CEA、Cyfra21-1和 NSE 相应的检出限(LOD)分别为0.11、0.18和0.28 ng/mL(按3σ/m计算，其中σ为空白的标准差，m为校准曲线拟合线的斜率)。通过同时检测验证了 NFC-LFIA 灵敏、特异的多目标定量能力。
4.患者样品中癌症生物标志物的评估
图8 (a-c) NFC-LFIA检测25名健康人和55名肺癌患者血清CEA (a)、Cyfra21-1 (b)和NSE (c)浓度的直方图；(d-f) NFC-LFIA定量检测25名健康人和55名肺癌患者CEA (d)、Cyfra21-1 (e)和NSE (f)的方框图。实线表示组的中位数(中线)和第三/第一个四分位数(上和下线)；(g-j)对临床样本CEA (g)、Cyfra21-1 (h)、NSE (i)和组合生物标志物(j)的NFC-LFIA进行ROC分析。
从图8a-f的直方图和方框图可以看出，肺癌的确诊与不同生物标志物的血清浓度的正解释(浓度超过临界值)存在差异和部分相关性。三种生物标志物的受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线也证实 Cyfra21-1具有最高的曲线下综合面积(integrated area under curve, AUC)，值为0.884(图8h)，说明 Cyfra21-1对肺癌阳性/阴性组具有更好的识别能力。但仍有16例 Cyfra21-1阴性肺癌患者未被发现（误诊）。尽管单个 CEA(25.5%)或 NSE(29.1%)对肺癌的诊断相对较低，与单独 Cyfra21-1诊断相比，三种生物标志物联合检测显著提高了敏感性，灵敏度高达92.7%(12例Cyfra21-1阴性患者被诊断为阳性)，特异性为92.0%。对 CEA、Cyfra21-1和 NSE 联合检测进行 ROC 分析，AUC 值显著提高为0.975(图8j)，肺癌阳性组和肺癌阴性组对临床血清样本的识别能力较好。这些结果验证了 NFC-LFIA 平台对各个肺癌生物标志物的敏感性和特异性检测，以及多靶点联合检测对提升肺癌诊断价值的意义。
本项工作建立了一个基于 NIR-II 荧光的具有多靶点检测能力的LFIA平台，用于肺癌的血清学和即时诊断。通过巯基金属配位驱动组装实现疏水 PbS 量子点在中心-径向多孔二氧化硅模板中的致密均匀掺入。有机硅/二氧化硅双分子层封装保证了纳米标记的荧光特性和优良的光学/胶体稳定性(发射波长为1310 nm)。采用便携式 NIR-II 荧光条扫描器，单次检测可快速、简便地定量 CEA、Cyfra21-1和 NSE，检出限分别为0.11、0.18和0.28 ng/mL。结合三种生物标志物检测，肺癌患者和健康人群真实血清对肺癌的敏感性和特异性分别达到92.7%和92.0%，验证了当前平台对肺癌 POC 和血清学诊断的潜力。