内容预告：
1. Critical Comparison between Large and Mini Vertical Flow Immunoassay Platforms for Yersinia Pestis Detection
2. Electrochemiluminescence-Incorporated Lateral Flow Immunosensors Using Ru(bpy)32+-Labeled Gold Nanoparticles for the Full-Range Detection of Physiological C‑Reactive Protein Levels
NO.1 任静硕士
题目：Critical Comparison between Large and Mini Vertical Flow Immunoassay Platforms for Yersinia Pestis Detection
期刊：Analytical Chemistry
IF：6.785
鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）是一种革兰氏阴性菌，是鼠疫的病原体，甚至可以说是一种潜在的生物武器。鼠疫在诊断时会由于各种原因导致其诊断结果延迟，因此该疾病的致死率很高，所以需要对其进行早期诊断。鼠疫低钙反应V(LcrV)蛋白是诊断鼠疫的潜在病菌的生物标志物，可以通过对LcrV蛋白的检测来对鼠疫进行诊断。培养技术是检测鼠疫杆菌的金标准方法；但是它非常耗时，并且需要增加生物安全预防措施。其他的检测方法还包括显微镜分析、间接血凝集分析、酶联免疫吸附分析(ELISAs)、聚合酶链反应和光纤生物传感器测量，这些方法具有高灵敏度和特异性。然而这些技术昂贵耗时，且需要专业的实验人员。本研究的目的是开发一种快速、灵敏、特异且成本适宜的方法，因此在本文中提出了一个高灵敏度，纸基的垂直流动免疫分析(VFI)的模型，用于检测LcrV蛋白和诊断鼠疫。
VFI与传统的侧流免疫分析(LFI)相比，其检测性能已经显著提高。VFI系统的多路复用能力是在包括核酸、蛋白质和细胞在内的各种生物标记检测中建立检测装置的有效标准，并提供了一种用户友好、成本效益高和快速的诊断方法。基于此，各研究人员开发了基于VFI的免疫测定法，用于检测大肠杆菌基质金属蛋白酶 -8 和 -9，DNA扩增用于检测脑膜炎奈瑟菌，重组酶聚合酶扩增用于检测腺病毒，以及使用适体缀合的金纳米颗粒进行瓜氨酸检测的纸基垂直流表面增强拉曼散射（SERS）测定。LcrV抗原可能不会在患者样本中积累到足够高的水平，因此无法通过LFI进行检测，因此研发一种基于VFI的LcrV检测方法十分重要。
为了研究小型化效应，Frederic课题组探究了VFI的缩放规律，并对两种不同尺寸的VFI平台进行了LcrV测试，分别称为“大型VFI”和“微型VFI”。为了进行比较，在相同浓度的大面积纤维和小面积硝化纤维素(NC)膜上固定捕获抗体(cAb)。然后通过将分析物和AuNP-dAb推过VFI平台，使目标与特定的cAb反应并根据分析物的浓度产生比色信号。此外，在流速、NC膜的选择和AuNP浓度等方面，对两个VFI平台上的检测进行了优化。最后微型VFI检测到LcrV蛋白的浓度低至0.025 ng/mL，比大型VFI平台的检出限提高了10倍。此外，将VFI的测定灵敏度与LFI进行了比较。采用自动图像分析软件对阵列强度进行定量分析。总体而言，微型VFI平台显示出作为定量免疫诊断的巨大潜力，能够在资源匮乏的环境中进行快速检测。
1． 大型和微型垂直流动免疫检测（VFI）平台的制备及原理
如图1所示，微型VFI装置包括NC膜、膜外壳、O形环、垫圈和Si支架，NC膜印有cAb阵列，夹在Si支撑和O形环之间。O形环密封膜的周边，保证流体流过膜而不会泄漏。在流通过程中，深蚀刻的硅支架机械地支撑膜以抵抗流动。聚碳酸酯外壳的下部固定NC膜。使用市售的鲁尔螺纹接头将膜封装到外壳中，并使用鲁尔螺纹接头的另一侧连接到注射器。然后将膜外壳连接到带有注射泵的压力驱动系统，推动液体通过膜。
图1 小型垂直流免疫分析法(VFI)平台示意图及操作原理
2． 微型VFI平台的检测条件优化
在本研究中，在0.1 μmVFI装置上用5 mL试样（2.5 ng/mL）的0.1、0.2、0.5、1 mL/min，结果如图2所示。当流速降低时，测试点信号增加。在0.1 mL/min的最低流速下，信号(~16,000 A.U.)比最高流速1 mL/min (~1500 A.U.)强约10倍。在0.2 mL/min流速下，信号比1 mL/min流速增加了大约7倍。在低流速下，Ag/AuNP-dAb复合物有足够的时间与cAb反应并形成免疫复合物。相比之下，Ag/AuNP-dAb复合物可以在更高的流速下脱cAb 上的结合，降低测试点强度。多项研究还证实，在较低流速下分析物利用率会增加，而在较高流速下会降低捕获效率，这与我们的结果非常吻合。因此，选择0.2 mL/min的流速进行进一步优化，因为流速在我们的目标25 min流体流动时间内表现出强大的测试点强度。对于大型VFI，使用55 mL样品体积和25 min的固定流体流动时间作为测定时间外推2.2 mL/min的流速，与微型VFI的相同。
另外，VFI灵敏度受AuNP-dAb试剂浓度的影响。确定AuNPs的最佳浓度可以保持高特异性，不会产生任何假阳性结果。优化涉及以0.2 mL/min的流速分析一系列浓度的AuNP-6F10，没有任何抗原；实验结果如图2b所示。选择3 pM的AuNP进行进一步分析，因为该浓度几乎达到饱和点而不会产生非特异性反应信号。正如Zimmermann等人所建议的那样，高浓度的dAb可以提高Ag-Ab的反应速率。然而，过量浓度的AuNP-dAb可能会导致非特异性结合。因此，3 pM AuNP浓度用于在微型VFI中进行检测，4.5 pM用于大型VFI膜，因为这些浓度的AuNP不会产生任何非特异性结合或假阳性结果。
图2 样品流速和AuNP浓度对小型VFI平台LCRV试验的影响.
3． 微型VFI平台上的LcrV分析
图3a显示了在微型VFI平台上测试的不同LcrV浓度的测试点强度。随着LcrV浓度的降低，强度逐渐降低。5 ng/mL LcrV的测试点强度约为19,000 (A.U)，并在0.025 ng/mL时逐渐降低至700 (A.U)（图3b）。
图3 微型VFI平台上的LcrV分析. a 基于迷你VFI平台上的浓度，产生颜色强度 b LcrV检测的定量结果，其中迷你VFI设备显示测试点信号强度高达0.025 ng/mL。
4． 大、微型VFI平台的比较分析
与从微型VFI中的5 ng/mL LcrV获得的信号相比，含有5 ng/mL LcrV的5 mL样品体积的测试点强度降低了60倍，如图4c、d所示，这是等于微型VFI中0.025 ng/mL LcrV的值。由于较少的测试点强度生成必须影响LOD，测试样本的体积增加了11倍。图4a显示了大型和小型VFI设备的组件。与较大的注射器相比，较小的注射器区域需要较小的力来驱动注射器。此外，较小的膜面积需要较少的样品和试剂。如果相同体积的样品以相同的速度通过传感器，则测定性能应该相同。通过将VFI膜直径从2.5 mm增加到10 mm，样品体积可以增加16倍。然而，由于注射器尺寸的实际限制，大型VFI平台使用了11倍的样品体积，而不是16倍。
图4 大、微型VFI平台的比较分析
5． 大型VFI平台中的LcrV分析
图5a、b显示了不同浓度的55 mL LcrV样品的信号强度，如在大型VFI中检查的那样。总体而言，测试点强度增加了10倍，试剂体积增加了11倍。
图5 大型VFI平台中的LcrV分析
6． LFI装置中的LcrV分析与VFI装置中的特异性分析
图6 LFI装置中的LcrV分析与VFI装置中的特异性分析
VFI系统消除了传统固相阵列的几个缺点，包括在通过膜注射样品期间需要大量样品和蛋白质损失。在这项研究中，Frederic团队展示了一个基于纸质的VFI平台，用于通过POC方法成功诊断LcrV。在过去的十年中，研究实验室开发了各种小型化免疫诊断设备，并作为商业产品销售。大多数这些小型化设备的开发主要优势是具有成本效益、使用较少的样本量、提供快速行动以及在资源有限的环境中有用。除了这些潜在的优势和好处之外，Frederic团队的第二代微型VFI设备保留了所有原始优势，并进一步提高了LOD，具有高灵敏度和特异性，同时减少了样品量。此外，未来的研究将侧重于集成无动力泵系统和基于智能手机的定量分析来检测临床样本中的LcrV，以在资源匮乏的环境中建立该设备。我们相信，这种简单且廉价的微型VFI设备将成为利用POC方法扩大免疫测定和核酸测定潜力的合适平台。
原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c05278
NO.2 胡慧兰硕士
题目：Electrochemiluminescence-Incorporated Lateral Flow Immunosensors Using Ru(bpy)32+-Labeled Gold Nanoparticles for the Full-Range Detection of Physiological C‑Reactive Protein Levels
期刊：Analytical Chemistry
IF：6.78
C反应蛋白(CRP)是最具代表性的急性磷酸酶蛋白，其浓度在对炎症(如感染和自身免疫性疾病)或组织损伤(如损伤、手术、心肌梗死和肿瘤)的反应中增加。在这些疾病中，CRP浓度的升高可在很大范围内变化；轻度炎症或病毒感染时为10-40 μg/mL，活动性炎症或细菌感染时为40-200 μg/mL，严重感染时> 200 μg/mL。因此，CRP被用作诊断和监测感染性和自身免疫性疾病的主要炎症标志物，对其进行检测很有必要。侧向流动免疫传感器(LFI)可用于检测复杂样品中的目标分析物，由于其快速性、成本效益和用户友好性，它是最突出的现场快速检测(POCT)诊断格式。尽管如此，常规LFI已被证明不能令人满意地检测生理性CRP浓度的全部范围(1-500 μg/mL)，因为它们的检测范围狭窄。电化学发光(ECL)，是最敏感的分析应用中使用的技术。其具有高灵敏度、宽线性检测范围、空间可控性和快速分析的显著优点。
Ru(bpy)32+是一种广泛使用的代表性ECL试剂，因为它具有良好的水溶性、高ECL量子产率和高电化学稳定性。此外，它可以在ECL反应中重复再生。近年来，纳米材料在ECL的引入使ECL生物传感器的灵敏度和多样性发生了革命性的变化。特别是，基于Au NP的ECL信号放大策略由于Au NP的优异特性，包括电化学效应、大表面积和良好的生物相容性，在检测真菌毒素、癌细胞、和肿瘤生物标记物的分析应用中获得了广泛的关注。
Kim课题组通过一个简单的涉及电极插入的修改，将ECL和侧向流动检测平台结合起来。通过合成(Ru(bpy)32+)标记的Au NPs(~20nm)，使用AuNP缀合物用于CRP检测的单步ECL测量。其次通过对ECL-LFI的进一步优化，固定了CRP靶向抗体的发光AuNP使得具有双重电化学和ECL读出能力的高灵敏度ECL检测成为可能。最后，将ECL-LFI法成功地应用于定量30份临床血清样本中的CRP，分析时间少于15min。
1． ECL-LFI示意图
图1. ECL-LFI原理图.
2. 钌(bpy)32+-标记的偶联物的表征及在ECL-LFI带上ECL反应的优化
图2 Au NP缀合物表征图（透射电镜图、Zeta电位与紫外光谱）与优化条件（Au NP缀合物浓度、pH值与热塑性聚合物浓度）.
3. 分析ECL-LFI法检测血清中加标CRP的性能
由图三可知，我们采用优化的AuNP缀合物，通过用电荷耦合器件照相机每秒测量ECL信号100秒来进行CRP检测。使用内置软件确定100幅图像的累积强度，与比色检测相比，ECL的加入将灵敏度提高了2个数量级（图3-A）。通过ECL和比色强度作为加标血清中CRP浓度的函数的比较图说明了ECL-LFI的敏感性（图3-B）。测试线的ECL强度随着CRP浓度的增加而增加，呈现0.01-1000 ng/mL的线性动态范围（图3-C）。
图3 ECL-LFI法检测血清中加标CRP的性能.
4. ECL-LFI法检测临床样本中CRP的检验
由图4可知，ECL-LFI允许在0.04至1000 ng/mL的浓度范围内检测临床样本中的CRP，这表明比色低频具有更高的灵敏度和更宽的检测范围。由表1可知，与基于LFI格式的其他CRP检测方法相比，ECL-LFI法被证明是高度敏感的，并且具有较宽的动态检测范围。这表明ECL-LFI在高灵敏度的POCT生物标志物检测领域具有广阔的前景。
图4 ECL-LFI法检测临床样本中CRP的实用性检验.
表1用LFI格式检测CRP的各种方法比较
综上所述，该研究开发了一种ECL-LFI法，用于高灵敏度检测CRP，具有较宽的动态检测范围。将ECL结合到一个稍微改进的LFI系统中，使用Ru(bpy)32+标记的Au NP缀合物作为CRP靶向探针和ECL信号发生器。同时通过避免受体固定的繁琐步骤来确保实用性，并利用传感器外壳来克服电极和发光试剂之间的距离带来的缺点，以获得稳定的信号。这允许单步ECL测量、简单的双信号读出、优异的定量、高灵敏度和宽动态检测范围。ECL-LFI法可以检测血清中的CRP，检出限为4.6 pg/mL，加标浓度为0.01-1000 ng/mL，比LFI比色法宽2个数量级。更重要的是，ECL-LFI法成功地应用于临床样品中的CRP检测，具有较高的准确度和良好的线性。因此，它可以很容易地适用于其他生物标志物的检测和治疗监测。
原文链接： https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c00623
图文编辑：任静 胡慧兰
图文审核：汪蓉
指导老师：张道宏 王建龙