内容预告：
1. A nanobody suite for yeast scaffold nucleoporins provides details of the nuclear pore complex structure
2. Creation of a Nanobody-Based Fluorescent Immunosensor Mini Q‑body for Rapid Signal-On Detection of Small Hapten Methotrexate
NO.1 白梦凡硕士
题目：A nanobody suite for yeast scaffold nucleoporins provides details of the nuclear pore complex structure
期刊：Nature Communications
IF：12.121
核孔复合物（NPC）是分子跨膜交换的主要管道，可以控制物质进出细胞核。为了研究NPC的具体结构，不同的实验室采取自上而下或自下而上的方法来解决。在过去的十年，通过X射线晶体学、冷冻电子断层扫描（cryo-ET）对NPC的结构已有了更深入的了解。目前，作者团队已得到了酿酒酵母Y复合物的完整模型，并且使用cryo-ET可视化整个NPC。虽然这些研究提高了我们对NPC整体结构的理解，但cryo-ET图谱的分辨率并没有揭示其二级结构。这就为进一步的探索和改进留下了空间。本文旨在构建一套工具，以帮助人们更详细的研究复杂的NPC组装。
本文构建了一个纳米抗体文库，该文库包含12个独特性的纳米抗体，它们可以识别Y复合物和Nic96的七个组成性的核孔蛋白。这些纳米抗体都具有高特异性和高亲和力。此外，本文还介绍了几种核孔蛋白-纳米抗体复合物的结构，揭示了它们的结合位点。纳米抗体的基本表达可以检测到Y复合物和Nic96的表面。总之，这组纳米抗体为核孔复合物的研究提供了独特且通用的工具。
1. Y复合体和Nic96的纳米抗体文库
为了获得核孔蛋白的特异性纳米抗体，作者用重组纯化的Y复合物和Nic96免疫羊驼。然后，通过噬菌体展示技术淘选纳米抗体，我们获得了覆盖Y复合体短臂、中心和长柄的纳米抗体（图1b）。此外，本文构建了一组含有12个结合Y复合物和Nic96的纳米抗体(图1b, c)。该文库涵盖了广泛的序列空间(图1c)，其中互补决定区域(CDRs) 1和2的序列和长度相似度高于CDR3。
图1.(a)NPC的组装原理图和酵母核孔蛋白(Nup)的分类；(b)用于羊驼免疫的Y复合物和Nic96的示意图，噬菌体展示的选择片段，以及形成的纳米抗体文库；(c)纳米抗体文库的序列比对。
1. 纳米体以不同的动力学结合，具有高亲和力
为了表征纳米抗体文库的结合动力学，本文采用了生物膜干涉技术。将每个碳未端生物素化的纳米抗体固定在包被链霉亲和素的生物传感器芯片上。通过分析每个纳米抗体与Nup靶标抗原的结合，得到了纳米抗体文库的结合动力学(图2)，由图可知，纳米抗体可以非常稳定的与其抗原结合。
图2.(a)Y配合物和Nic96纳米抗体文库的示意图；(b)纳米抗体-核孔蛋白的结合曲线。
1. X射线晶体学绘制纳米抗体表位
通过多个核孔蛋白-纳米抗体配合物的晶体结构，绘制了纳米抗体的多个表位，这使我们能够更详细地观察结合表位。图3展示了Y复合物和Nic96纳米抗体的结构。利用scNup85trunk -crown- seh1的结构作为模型，通过分子置换(MR)方法得到了Nup85trunk-crown-Seh1与VHH-SAN2的复合结构。
4.VHH-SAN10识别Nup120中的循环
以scNup1201-757的结构作为模型，通过MR得到了复合物Nup1201-757-VHH-SAN10/11的结构。对Nup120的突变分析证实了VHH-SAN10的结合位点（图4）。用柔性连接子(GSSx3)替换431-439残基，并检测VHH-SAN10与VHHSAN11的结合，结果表明VHH-SAN11与431-439区域结合(图4b)。此外，VHH-SAN11可以与Nup120进行识别（图4c）。
5.VHH-SAN12与Nic96的结合
除了Y复合纳米抗体，我们还鉴定了一个纳米抗体VHH-SAN12，它可以与内环复合物Nic96进行结合。以scNic96186-839结构为模板，通过MR得到了Nic96186-839与VHH-SAN12复合物的结构（图5a）。此外，Nic96-VHH-SAN12的结构还突出了ACE1折叠的灵活性。
图5.(a) Nic96-VHH-SAN12的结构；(b)Nic96与a图中的结构叠加；(c)Nic96冠状模块在两种结构之间的叠加。
6.NPC纳米抗体在体内定位于核膜上
图6展示了Nb-mkate2融合蛋白在体内的表达，在30°C和37°C下，纳米抗体表达不存在缺陷(图6a)。在没有任何纳米抗体表达的情况下，Nup120-GFP的核边缘荧光清晰，而mKate2单独产生漫射荧光，贯穿整个细胞质和细胞核(图6b)。
图6.(a)Nb和Nb-mkate2表达的点检测；(b)标记Nup120-GFP的细胞内源性表达荧光图像。
本文构建了一个纳米抗体文库，该文库包含12个可与Y复合物和Nic96结合的纳米抗体。这些纳米抗体可与其靶标紧密结合，具有纳米摩尔的结合亲和力。文章中使用生物层干涉法(BLI)、尺寸排除色谱法(SEC)描述了它们的体外结合特性，用X射线晶体学描述了它们的结合结构。纳米抗体文库作为研究NPC在体外和体内的工具，并为未来探索酿酒酵母NPC的组装和组成奠定了基础。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41467-020-19884-6
NO.2 王烨硕士
题目：Creation of a Nanobody-Based Fluorescent Immunosensor Mini Q‑body for Rapid Signal-On Detection of Small Hapten Methotrexate
期刊：ACS Sensor
IF：7.333
甲氨蝶呤 (MTX)在癌症化学治疗中至关重要，已成为癌症治疗中重要的测定靶标。MTX不仅可以扩展到癌细胞，而且还能扩展到正常细胞，并破坏二氢叶酸还原酶的活性，后者在DNA合成中起关键作用。 因此，在癌症化疗中服用高剂量的MTX时，应监测MTX的血药浓度以最大程度地减少副作用。
免疫定量MTX方法的发展引起了人们的极大关注，一些检测MTX的 ELISA试剂盒已经商业化，这些方法实现了较低的定量限（〜50 nM），但是多个反应步骤和专业技术知识的要求给即时检测带来巨大的困难。所以我们仍然存在对更高灵敏度和更强可用性的检测方法的需求。
同时，自1993年被发现以来，新型抗体片段即纳米抗体（也称为VHH）已成为一种强大的生物学工具。我们可以构建基于抗MTX纳米抗体的Q-body来检测化学治疗剂MTX。
文章中构建了一种基于纳米抗体的“Q-body”，可以在临床上进行检测MTX。文中将包含用于标记染料的Cys残基的Cys标签引入到纳米抗体的N-末端，并通过改变接头长度和荧光染料来探索Q-body的最佳结构。最终，成功构建的Q-body可用于快速地定量人血清中的MTX。
1. 纳米抗体的表达和抗原结合活性的验证。
如图1，文中构建了编码MTX纳米抗体的三个表达载体，在N端加了Cys标签和（GGGS）n接头（n= 0、2和4）。同时将His标签和FLAG标签添加至纳米抗体的C端，这是对纳米抗体进行染料标记的必要条件。通过核苷酸测序确认了载体pSQ-MTXVHHs的成功构建序列。该载体用于表达和纯化MTX纳米抗体，通过SDS-PAGE对纯化得到的蛋白大小进行估计。如图2a，对于每个泳道，观察到大约18 kDa的粗蛋白条带，与每个样品的理论分子量17.0、17.7和18.3 kDa吻合得很好，表明它们按设计正确表达。另外，使用ELISA测量MTX纳米抗体与固定化抗原MTX-BSA的结合活性来评估抗原结合活性，图2b表明MTX纳米抗体可以保留其抗原结合活性而不受N端的Cys标签和GGGS接头的影响。
图1.（a）Q-body的示意图。 （b）pSQ-MTXVHHs的编码结构示意图。
图2.（a）纳米抗体的SDS-PAGE的CBB染色。每个样品的洗脱液在三个泳道中流动（b）抗原结合纳米抗体的活性。空白和实心条代表分别使用BSA和MTX-BSA。误差棒代表±1 SD（n = 3）。
2.Q-body的制备和分析
用马来酰亚胺染料标记纯化的纳米抗体以制备Q-body，通过马来酰亚胺-硫醇反应分别将4种马来酰亚胺染料（TAMRA-C5-mal，TAMRA-C6-mal，ATTO520-C2-mal和R6G-C2-mal）标记在纯化的纳米抗体的Cys残基处，进行荧光标记并通过抗FLAG珠纯化后，进行SDS-PAGE分析Q-body的迁移率和荧光。
使用荧光读数器评估每个Q-body的活性。首先测量添加7 M GdmHCl变性剂和1μM MTX变性后的荧光响应值，两者分别对应于淬灭程度和抗原依赖性恢复。如图3所示，用不同染料标记的Q-body的荧光响应显示出不同程度的猝灭， TAMRA-C6标记的Q-body的猝灭效果比其他三种染料标记的Q-body更强。同时没有接头的TAMRA-C6标记的Q-body表现出更强的淬灭性。为了进一步分析TAMRA-C6标记的Q-body，我们测量了TAMRA-C6标记的Q-body在0–1 μM MTX存在下的荧光光谱。如图4所示，最大荧光峰出现在580 nm附近，这与TAMRA染料的光谱相对应，并且荧光强度根据MTX浓度增加而增加。最后通过曲线拟合对最大发射波长处的强度进行拟合，绘制了具有不同GGGS接头的TAMRA-C6标记的Q-body体的剂量反应曲线（图5）。
图3. 荧光标记纳米抗体的淬灭和抗原依赖性恢复。(a) TAMRA衍生物和 (b) T5、T6、520和R6G分别对应于TAMRA C5，TAMRA C6，ATTO520和Rhodamine 6G。L0，L2和L4对应于没有接头，(GGGS)2，(GGGS)4。阴影线和实心条表示添加变性剂（7M GdmHCl和1μM MTX）。误差棒代表±1 SD（n = 3）。
图4. TAMRA C6标记的没有接头Q-body在添加指定量的MTX时的荧光光谱
图5. TAMRA C6标记的具有不同长度接头的Q-body在0-1μM MTX时的剂量反应曲线。 误差棒代表±1 SD（n = 3）。
3. Q-body与纳米抗体的相似亲和力
使用生物层干涉术对荧光染料标记的纳米抗体进行了动力学分析。结果表明，MTX纳米抗体的亲和力受荧光染料标记的影响最小，并且显示与EC50相似的值。单一荧光染料（TAMRA）标记对纳米抗体亲和力影响很小（表1）。
表1. 蛋白质与固定的MTX的结合常数
4. Q-body在人体血清中的应用
Q-body可以在50％的人血清中检测到MTX，检出限低至1.72 nM，显示了其在治疗药物监测中的适用性，进行Q-body在实际样品中的MTX定量实验，如表2所示，加标样品的回收率在109.4–136.4％的范围内，这表明基质对Q-body检测没有太大的影响，可以将其应用于快速定量人血清中的MTX。
表2. 加标样品的MTX回收率
在本研究中，成功开发了Q-body来检测低分子量抗原MTX，由于与常规抗体相比其互补位较小，因此被认为具有挑战性。以具有高亲和力的纳米抗体为基础，通过探索合适的接头长度和猝灭效果更强的染料结构，构建成功的Q-body在低浓度范围内成功检测出MTX。由于之前没有尝试制造基于纳米抗体的Q-body，因此从两个方面对基于纳米抗体的Q-body进行了表征：淬灭机理和结合动力学。所选的Q-body在50％的人血清中显示出低的检测限（1.72 nM）。据我们所知，该LOD与现有分子探针（包括用于MTX检测的纳米材料光学探针）的LOD一样低。 同样，与LC-MS或竞争性分析相比，Q-body分析可实现更简单，更快速的定量检测。
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acssensors.0c01404
图文编辑：白梦凡 王烨
图文审核：汪蓉
指导老师：王妍入 王建龙