在日常饮食中由于过量摄入高热量糖会引发各种慢性疾病，如过度肥胖、糖尿病、高血压和心脑血管疾病等，已成为世界范围内的广泛关注问题。因此，利用低热量或无热量甜味剂替代高热量糖成为一种理想的方案。而来源于植物甜叶菊的天然甜味剂莱鲍迪苷D（Reb D）因具有无热量（无法被人体直接代谢吸收）和良好的口感而被认为是新一代的甜味剂。然而，Reb D在甜叶菊叶片中的含量较低（仅占甜叶菊叶子干重的0.4-0.5%），导致难以利用传统的植物萃取方法进行规模化生产以满足市场需求。而利用酶法制备Reb D则面临催化Reb D合成相关的糖基转移酶普遍存在异源可溶性表达水平低和催化活性较低的问题。
针对上述问题，江南大学饶义剑教授课题组通过筛选获得具有催化合成Reb D活性且在大肠杆菌表达系统中能够良好可溶性表达的细菌来源的糖基转移酶YojK，通过解析YojK蛋白质结构和理性改造提高了糖基转移酶YojK的催化效率，通过构建级联反应以及条件优化实现了Reb D的高效制备，并利用分子动力学模拟解析了突变体催化效率提高的分子机制。该成果以“Highly Efficient Production of Rebaudioside D Enabled by Structure-guided Engineering of Bacterial Glycosyltransferase YojK”(DOI: 10.3389/fbioe.2022.985826)为题在线发表在Frontiers in Bioengineering and Biotechnology。首先，通过糖基转移酶筛选获得具有催化合成Reb D活性的糖基转移酶YojK，并通过液相质谱分析和核磁共振波谱分析确定了产物结构为Reb D（Figure 1）。为了探究YojK的催化机制解析了YojK的蛋白质结构（Figure 2）。针对YojK催化活性较低的问题，通过基于蛋白质结构选取底物结合口袋周围关键氨基酸残基R72、F131、M133、F137、M141、Y145、K147、I241、G326、G327、F330和V331，采用丙氨酸扫描突变、定点饱和突变和组合突变的策略对YojK进行改造，最终获得催化活性是野生型YojK的7.35倍的突变体YojK-I241T/G327N（Figure 3，Figure 4）。
Figure 1. YojK has the catalytic ability to glycosylate Reb A to produce Reb D.
Figure 2. Crystal structure analysis of YojK-UDP complex.
Figure 3. Site-directed mutagenesis of YojK to improve its catalytic activity.
Figure 4. Iterative evolution of YojK.
随后，作者通过分子动力学模拟解析了突变体YojK-I241T/G327N催化效率提高的分子机制。结果表明，突变体YojK-I241T/G327N中Reb A的C-19位羧酸基团葡萄糖2位羟基氧原子与H14的NE2氮原子之间的距离以及Reb A的C-19位羧酸基团葡萄糖2位羟基氧原子与尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）的葡萄糖1位碳原子C-1之间的距离相较于野生型YojK(WT)更短和更加稳定（Figure 5A，5B）。通过分析突变体YojK-I241T/G327N与WT的典型构象发现，突变体YojK-I241T/G327N中由于与底物Reb A和糖基供体UDPG之间形成新的氢键（Figure 5C，5D），使得在催化过程中催化构象更加稳定从而使催化活性提高。
Figure 5. The representative catalytic conformations of WT-UDPG-Reb A and YojK-I241T/G327N-UDPG-Reb A in MD stimulations.
为了高效制备Reb D，作者引入拟南芥来源的蔗糖合酶AtSuSy与突变体YojK-I241T/G327N构建级联反应，其中，AtSuSy用于原位再生糖基供体UDPG。通过对级联反应中pH、反应温度、DMSO含量、蔗糖浓度、底物浓度和反应时间等因素的优化，最终利用19.32 g/L Reb A以91.29%的产率制备了20.59 g/L Reb D（Figure 6）。
Figure 6. Optimization of the cascade reaction conditions for YojK-I241T/G327N-AtSuSy.
综上所述，该研究通过筛选得到具有催化合成Reb D活性且具有良好可溶性表达水平的糖基转移酶YojK，为Reb D的制备提供了新的选择，通过基于蛋白质结构的理性改造获得具有高催化活性的YojK突变体并实现了Reb D的高效制备，为规模化制备Reb D奠定了基础。
江南大学生物工程学院博士生郭保党和侯晓冬为该论文的共同第一作者，江南大学生物工程学院饶义剑教授为该论文的通讯作者。该工作得到了国家重点研发计划（2018YFA0901700）和江苏省自然科学基金（BK20202002）等基金的资助。