1. 引言

重度抑郁症（MDD）已成为自杀的首要原因，于此同时，抑郁症具有极高的致残率，因此给个人、家庭、和医疗系统带来沉重负担。这使得深入探讨抑郁症发病的详细分子机制、发现新的治疗靶点显得尤为迫切。突触可塑性降低和氧化应激是MDD的两个主要特征。线粒体不仅能够通过ATP合成直接影响突触可塑性，并且是细胞内氧化还原信号调控的主要细胞器，这表明线粒体和抑郁症的发生发展具有密切关系。然而，抑郁小鼠海马线粒体损伤特征及其详细分子机制仍不明确。

O₂^•–作为线粒体产生的第一种活性氧，其浓度能够直接反映线粒体的氧化应激程度，过量的O₂^•–可以与多种蛋白质相互作用并导致线粒体损伤。因此，线粒体O₂^•–水平升高可能是导致应激易感小鼠海马区线粒体功能障碍的原因，为了了解抑郁症的分子机制，精确量化抑郁样行为小鼠海马内原位线粒体O₂^•–的变化势在必行。此外，阐明O₂^•–的动态时空波动将有助于揭示O₂^•–在应激易感小鼠海马线粒体损伤和形态变化过程中的作用。尽管一系列O₂^•–荧光已经被开发出来，然而与O₂^•–反应后具有迁移性的荧光探针无法精准反映O₂^•–的空间信息。特别是考虑到O₂^•–的低浓度和高反应活性的特点使得O₂^•–的作用空间非常有限，凸显了记录O₂^•–的时空信息对于精确反映O₂^•–在不同亚细胞空间中的通量和理解O₂^•–在生理病理中作用的必要性。因此，发展具有时空标记性能的O₂^•–荧光探针是解析抑郁症大脑海马区神经元中线粒体O₂^•–在外周分裂中的作用的有力工具。

2. 成果简介

基于以上背景，山东师范大学唐波教授/李平教授课题组发展了一种基于串联活性基团的传感和标记策略的荧光探针RB-FM，用于线粒体损伤过程中O₂^•–的原位、高精度成像。借助该探针成功揭示了O₂^•–介导的应激易感小鼠海马神经元中线粒体外周分裂增加的新机制。该成果以“Superoxide Anion-Dependent Mitochondrial Fission Contributes to Hippocampal Synaptic Dysfunction in Stress-Susceptible Mice”为题发表在国际权威杂志JACS Au上。文章第一作者是山东师范大学博士研究生李玺威。巴斯大学Tony D. James教授、山东师范大学李平教授、山东师范大学王昕副教授和山东师范大学唐波教授为论文共同通讯作者。

在本文中，为了能够高精度示踪O₂^•–的时空信息，作者构建了一种基于串联活性基团的传感和标记策略荧光探针RB-FM，在探针与O₂^•–反应后会生成不稳定的醌甲基中间体，随后能够迅速和周围的生物亲核物种进行共价连接，从而记录O₂^•–的时空信息。借助探针RB-FM，我们观察到应激敏感小鼠的海马区神经元树突棘密度的降低伴随着线粒体O₂^•–浓度的显著升高和外周分裂增加。结合进一步的组学分析，我们揭示了一种抑郁症相关的病理性级联反应。该级联反应始于海马区神经元Ca²⁺浓度升高，进而导致线粒体O₂^•–依赖性的Coq4降低和Parkin升高，随后发生线粒体外周分裂，最终导致神经元突触可塑性下降。

3. 图文解说

图1 探针对O₂^•–的光谱响应和原代神经元中O₂^•–的荧光共聚焦成像。(a) RB-FM响应O₂^•–前后的荧光和吸收光谱。(b) RB-FM响应O₂^•–的动力学。(c) RB-FM响应不同浓度O₂^•–后的荧光光谱。(d) RB-FM荧光强度和O₂^•–浓度之间的线性关系。(e) 成像原代神经元中的O₂^•–。(f) 使用RB-FM和MitoTracker green成像原代神经元和(g) PC12 细胞中的O₂^•–和线粒体。

图2 小鼠行为学测试、小鼠海马树突棘密度、O₂^•–浓度和线粒体状态检测。(a) 行为学测试和抑郁样小鼠海马病理改变示意图。(b) 行为学测试。(c) 海马神经元高尔基染色。(d) 海马线粒体O₂^•–成像。(e) 海马线粒体膜电位和ATP检测。(f) 海马切片电子显微镜成像。(g) 海马线粒体外周分裂占比和线粒体尺寸统计。

图3 O₂^•–依赖的线粒体功能损伤和线粒体外周分裂。(a) 原代神经元线粒体膜电位检测。(b) 线粒体形态成像。 (c) 谷氨酸刺激下线粒体形态动态成像(d) O₂^•–浓度变化和线粒体形态的动态追踪。

图 4. 应激敏感小鼠海马神经元Ca²⁺浓度升高导致mtO₂^•–增加并驱动线粒体外周分裂。(a) 病理级联信号通路示意图。(b) 正常小鼠和应激敏感小鼠海马蛋白组学的DEGs聚类分析。(c) 应激敏感小鼠海马蛋白质互作网络分析。(d) Coq4和 Parkin 的表达和O₂^•–的关系。(e) Go富集显示应激敏感小鼠 Ca²⁺稳态异常。(f) AVV-hSyn-GCamp6s成像海马Ca²⁺浓度。(g) Ca²⁺调控线粒体形态和O₂^•–浓度的成像。

图5 级联信号通路示意图

4. 总结与展望

总之，线粒体O₂^•–可能通过介导海马区神经元中的线粒体损伤而促进抑郁发生发展，因此，建立其动态变化与线粒体结构/功能改变之间的时空关联对于阐明特定的病理机制至关重要。为解决这一问题，我们首次开发了一种荧光传感和标记策略，以精确捕捉O₂^•–的时空信息。所开发的基于荧光的成像探针（RB-FM）能够快速（<5 s）灵敏（LOD：0.75 nM）的与O₂^•–反应，并触发与附近生物亲核物质的共价荧光标记。这有助于实现在应激易感小鼠海马神经元线粒体损伤期间，对伴随突触可塑性变化的O₂^•–进行高精度原位成像。值得注意的是，我们在应激易感小鼠海马神经元中发现了一种有趣的线粒体损伤形式：在线粒体分裂总量和线粒体自噬水平保持不变的情况下，线粒体O₂^•–驱动的线粒体外周分裂显著增加。我们进一步揭示了一条与抑郁相关的级联信号通路，在应激敏感的小鼠海马体中，Ca²⁺水平升高导致mtO₂^•–增加，进而造成线粒体相关蛋白表达异常，最终导致线粒体外周分裂，从而损害突触可塑性。这项研究为O₂^•–对线粒体外周分裂的控制机制提供了框架，并展示了氧化还原信号如何与抑郁症中的突触可塑性相互作用。

5. 全文链接

全文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.5c00493

6. TOC