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祝贺 | 课题组开发了一种靶向肝星状细胞的双光子荧光探针用于揭示O2·−诱导肝癌免疫逃逸的详细机制
发布时间:2024-05-27

1. 引言:

肝星状细胞(HSCs)是肝脏特有的一种非实质细胞,在维持肝脏内部稳态中发挥至关重要的作用。研究表明,在肝癌发生发展过程中,异常活化肝星状细胞(aHSCs)能够促进肝癌免疫逃逸,削弱肝癌免疫治疗疗效。然而,aHSCs如何调控肝癌免疫逃逸的详细分子机制仍不清楚。考虑到HSCs的活化过程伴随着脂质代谢和ROS的大量产生,能够引起肝癌微环境的氧化应激,进而深刻影响肝癌免疫逃逸,超氧阴离子(O2•−)作为最先生成的ROS,在脂质代谢过程中大量产生,且在氧化应激造成多种疾病过程中起关键作用。然而,由于缺乏合适的研究手段,当前并未有研究工作揭示aHSCs中的O2•−水平变化,以及如何调控肝癌免疫逃逸的详细分子机制。因此,迫切需要开发一种荧光探针,探究活体深层组织内HSCs中的O2•−的实时、原位、动态水平变化,能够为揭示aHSCs调控肝癌免疫逃逸的详细分子机制提供有效信息

2. 成果简介:

基于以上背景,山东师范大学唐波教授/李平教授课题组发展了一种双光子荧光探针TPH用于HSCs活化过程中O2•−的实时动态可视化,并揭示了HSCs中O2•−诱导肝癌免疫逃逸中的作用。该成果以Fluorescence imaging sheds light on the immune evasion mechanisms of hepatic stellate cells mediated by superoxide anion”为题发表在国际权威杂志Communications Biology上。山东师范大学博士研究生毛元涛和武传琛为本文的共同第一作者,山东师范大学王昕副教授山东中医药大学李霞教授山东师范大学李平教授和唐波教授为论文共同通讯作者。

本文中,作者报道了一种具有HSCs靶向、可逆的双光子荧光探针(TPH),TPH能够高灵敏、高选择性以及可逆响应O2•−TPH原位成像首次揭示了HSCs活化过程O2•−的过量产生作者揭示了HSCs活化细胞内O2•−细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4fizzy和细胞分裂周期20相关1(FZR1斑点型BTB/POZ蛋白SPOP)程序性细胞死亡配体1PD-L1)级联信号通路,首次阐明了HSCs活化过程中O2•−肝癌免疫逃逸过程中的重要性这项工作证实了TPH在揭示HSCs诱导肝癌免疫逃逸相关分子机制的巨大潜能。

3. 图文解说:

1  TPH的结构和响应机制为了构建具有HSCs靶向性的O2•−可逆响应荧光探针,咖啡酸作为O2•−特异性的识别基团和相应的荧光团,多肽序列作为HSCs的靶向基团。作为常用的O2•−清除剂,咖啡酸被用作O2•−高特异性的识别基团,O2•−特异性氧化咖啡酸中的苯二酚基团生成苯醌,从而促进蓝色荧光的产生。咖啡酸基团与O2•−的反应过程具有可逆性,有望动态追踪O2•−水平变化。


2  TPH的荧光性质。20 μM O2•−反应前后TPH的吸收光谱a和荧光光谱bcTPH490 nm处的荧光强度与O2•−水平的关系d加入不同浓度的O2•−0-20 μM后,TPH荧光光谱变化


3  LX-2细胞的O2•−荧光成像aLX-2细胞内源性O2•−荧光成像a1:对照组a2:2-Me(0.1µg mL−1O2•−刺激剂)孵育15分钟;a3:2-Me孵育后,加入Tiron(10 µM,O2•−清除剂)孵育30分钟。c)LX-2细胞活化过程的O2•−荧光成像c1:对照组c2:TGF-β1(5 ng mL−1孵育12 hc3:TGF-β1孵育后,加入Tiron(10 µM)孵育30分钟。b和(d)分别为a和c图的平均荧光强度输出。


4  不同活化程度LX-2细胞的O2•−荧光成像。a-e)不同TGF-β1浓度或时间孵育LX-2细胞的荧光成像fa-e的平均荧光强度输出。


5  不同活化水平HSCs的小鼠的双光子荧光成像。a-c为了构建具有不同活化水平HSCs的小鼠模型,分别腹腔注射橄榄油或CCl4溶液2、4和6周。对照组:橄榄油;CCl4组:20%的CCl4溶液。(d)抑制HSCs活化小鼠的荧光成像。首先向小鼠腹腔注射CCl4溶液6周,随后腹腔注射生理盐水溶液或D-青霉胺(D-pen,HSCs活化抑制剂)2周。


6  不同活化程度HSCs的小鼠肝癌模型的O2•−成像和免疫荧光染色。a-b普通HCC小鼠和aHSCs HCC小鼠O2•−成像和免疫荧光染色CD8+ T细胞c-daHSCs HCC小鼠HSCs活化被抑制的HCC小鼠的O2•−成像和免疫荧光染色CD8+ T细胞)。


7  不同活化程度HSCs的小鼠肝癌模型的免疫印迹实验a)普通HCC小鼠和aHSCs HCC小鼠的免疫印迹实验baHSCs HCC小鼠HSCs活化被抑制的HCC小鼠的免疫印迹实验

 

7  CDK4蛋白的质谱分析a组氨酸(His) 30bHis 68;cHis 95。

4. 总结与展望:

为了探索HSCsO2•−HCC免疫逃避中的作用,我们开发了一种双光子荧光探针TPH,用于特异性成像检测O2•−。利用TPH,我们观察到HSCs在活化过程中O2•−爆发。值得注意的是,我们发现不同活化水平HSCsHCC小鼠模型中,HCC微环境的免疫抑制能力与HSCs的激活状态相关。进一步的研究表明,HSCs活化生成的过量O2•−损伤CDK4的功能区域,导致CDK4失活。随后,FZR1磷酸化降低,导致更多的SPOP降解。SPOP的降低导致HCC小鼠中PD-L1的增加,最终诱导免疫逃逸。这项工作提供了HSCsO2•−介导肝癌免疫逃逸的分子机制。我们认为这项工作可以为了解HCC的发生和发展提供补充。同时,也有望为肝癌的免疫治疗方法提供新的思路。

5. 全文链接:

全文链接:https://doi.org/10.1038/s42003-024-06245-y

6. TOC: