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祝贺 | 课题组开发了一种双色/双可逆荧光探针成像揭示O2·−和ATP在肝脏缺血再灌注损伤中的关键作用
发布时间:2023-09-01

引言

肝脏缺血再灌注损伤HIRI是肝脏切除手术和肝脏移植手术中不可避免的并发症,是术后肝功能障碍和肝功能衰竭的主要原因。HIRI发展进程中,加剧的氧化应激与受损的能量代谢协同作用,共同在肝损伤中发挥重要作用。超氧阴离子(O2•−)和三磷酸腺苷(ATP分别为氧化应激和能量代谢相关的关键生物标志物。然而,由于缺乏合适的原位成像工具,O2•−ATP在HIRI中的时空波动以及它们如何协同参与HIRI的病理机制目前尚不清楚。现有的O2•−ATP响应型荧光探针由于其不可逆机制,不适合动态监测HIRI过程中O2•−ATP的水平变化。因此,迫切需要开发一种荧光探针,能够在HIRI过程中同时、可逆地检测O2•−ATP,这不仅能够监控HIRI过程中O2•−ATP的时空、动态变化,而且有望揭示O2•−ATPHIRI的相关性及调控机制。

成果简介

基于以上背景,山东师范大学唐波教授/李平教授课题组发展了一种双色双可逆分子荧光探针(UDP)用于HIRI过程中O2•−ATP的实时动态和同步可视化,并揭示了它们在HIRI中的相互关系和协同作用。该成果以Unveiling the Crucial Roles of O2•− and ATP in Hepatic IschemiaReperfusion Injury Using Dual-Color/Reversible Fluorescence Imaging”为题发表在国际权威杂志Journal of the American Chemical Society上。该项研究工作也是唐波教授/李平教授课题组2022年在Journal of the American Chemical SocietyJ. Am. Chem. Soc., 2022, 144, 1, 174–183; J. Am. Chem. Soc., 2022, 144, 30, 13586–13599上发表关于药物诱导的肝损伤ONOOATP的单/双光子成像与NIR-Ⅱ荧光引导HIRI的精准导航工作之后,在肝损伤研究方面取得的又一个突破性研究结果文章第一作者是山东师范大学博士研究生刘继红,山东师范大学张雯副教授、巴斯大学吴庐陵博士、Tony D. James教授、山东师范大学李平教授和唐波教授为论文共同通讯作者。

本文中,作者报道了一种兼具双色和双可逆性质的荧光探针(UDP),UDP对O2•−ATP的响应具有优异的灵敏度、选择性和可逆性,这使得UDP能够在蓝色和红色荧光通道中独立响应O2•−ATP水平变化,没有光谱串扰。UDP在HIRI过程中原位成像首次揭示了肝细胞和小鼠肝脏的同步O2•−爆发和ATP消耗。作者揭示了HIRI过程中细胞内的O2•−琥珀酸脱氢酶(SDH线粒体内的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH线粒体内的ATP—细胞内的ATP级联信号通路,首次阐明了O2•−ATPHIRI过程中的关联性。这项工作证实了UDP在动态监测HIRI和揭示HIRI发病机理的巨大潜能。

 图文解说

 

1  UDP的结构和荧光性质。A)UDP响应O2•−ATP的可逆发光机制。为了构建O2•−ATP双可逆响应的荧光探针,咖啡酸与罗丹明B分别作为O2•−ATP特异性的识别基团和相应的荧光团,二者通过二乙烯三胺连接。作为常用的O2•−清除剂,咖啡酸被用作O2•−高特异性的识别基团,O2•−特异性氧化咖啡酸中的对苯二酚基团生成苯醌,从而促进蓝色荧光的产生。修饰二乙烯三胺的罗丹明螺内酰胺衍生物由于具有多个氨基,已被证明是ATP高灵敏和选择性的响应位点。咖啡酸基团与O2•−的反应过程和罗丹明螺内酰胺部分与ATP的结合作用均具有可逆性,有望动态追踪O2•−ATP水平变化。(B)UDP响应不同浓度O2•−的荧光光谱。(C)UDP470 nm处的荧光强度与O2•−水平的关系D)UDPO2•−通道对常见干扰物质的选择性。(E)UDP响应不同浓度ATP的荧光光谱。(F)UDP在588 nm处的荧光强度与ATP水平的关系。(G)UDPATP通道对常见干扰物质的选择性

 

2  UDP的可逆性、光谱串扰和生物毒性评价A)添加O2•−(65 μM)和GSH(200 μM)后,UDP蓝荧光的可逆响应循环。(B)在22 mM ATP存在下,加入不同浓度的O2•−(0-65 μM)后,UDP在O2•−通道荧光光谱。C)与65 μM O2•−22 mM ATP反应前后UDP的吸收光谱。D)添加ATP(22 mM)和三磷酸腺苷双磷酸酶(1 U/N)后,UDP色荧光的可逆响应循环。(E)在65 μM O2•−存在下,加入不同浓度的ATP(0-22 mM)后,UDP在ATP通道荧光光谱。F)UDP的生物毒性评估。

 

3  2-甲基雌二醇(2-ME或寡霉素AOmy A刺激肝细胞中O2•−ATP波动的共聚焦荧光成像A)2-MEO2•−刺激剂)和钛铁试剂(O2•−清除剂)处理的肝细胞O2•−(蓝色通道,λex = 405 nm, λem = 420-490 nmATP(红色通道,λex = 514 nm, λem = 525-668 nm的共聚焦荧光成像。(B)Omy AATP抑制剂)和ATP处理的肝细胞O2•−ATP的共聚焦荧光成像。(C, D)分别为(A, B)的相对蓝色和红色荧光强度输出。

 

4  HIRI全过程中肝细胞O2•−ATP波动的动态可视化及HIRI药物NAC的干预效果A)缺血0分钟20分钟40分钟,缺血40分钟后再灌注20分钟、缺血40分钟后再灌注40分钟以及0.5 mM、1 mM NAC预处理组肝细胞O2•−(蓝色通道,λex = 405 nm, λem = 420-490 nm)和ATP(红色通道,λex = 514 nm, λem = 525-668 nm)进行荧光成像(B, C) A的相对蓝色和红色荧光强度输出。(D) ROS含量测定试剂盒测定HIRI不同时期的相对ROS水平。(E) ATP含量测定试剂盒测定HIRI不同时期的ATP水平。

 

5  HIRI期间小鼠肝脏中O2•−ATP动态的实时可视化。(A)操作示意图。(B)缺血0分钟、缺血20分钟、缺血40分钟及缺血40分钟再灌注20分钟、缺血40分钟再灌注40分钟小鼠肝脏中O2•−(蓝色通道,λex = 405 nm, λem = 420-490 nm)ATP(红色通道,λex = 514 nm, λem = 525-668 nm)的荧光成像。(C, D) B图的相对蓝色和红色荧光强度输出。

 

6  通过LC-MS/MS分析琥珀酸脱氢酶与O2•−反应的蛋白质组学。(A) C68, M71的氧化。(B) W47的氧化。(C) H57的氧化。(D) W218的氧化。*和红色表示的残基代表O2•−的修饰位点。

 

7  HIRI过程中细胞内的O2•−—SDH—线粒体内的NADH—线粒体内的ATP—细胞内的ATP级联信号通路。A)经不同处理的肝细胞的SDH活性分析。(B-C)经不同处理的肝细胞线粒体NADH含量。(D)经不同处理的肝细胞线粒体ATP含量。(E)在3-NPA作用下,使用UDP荧光成像肝细胞ATP。(F) E图的相对红色荧光强度输出。(G)经不同处理的肝细胞细胞ATP含量。(H)HIRI过程中细胞内的O2•−—SDH—线粒体内的NADH—线粒体内的ATP—细胞内的ATP级联信号通路。

总结与展望

本文成功开发了一个对O2•−ATP具有高灵敏度和卓越选择性响应的双色双可逆的分子平台(UDP)。UDP能够同时、可逆响应O2•−ATP,并且独立监控蓝色和红色通道内的荧光,而不受光谱串扰的影响。得益于探针在体外响应O2•−ATP出色的性能,UDP成功被用于同时成像与动态监测肝细胞内源性的O2•−ATP水平。通过分离良好的蓝、红光,UDP进一步被用来实时、原位可视化HIRI全过程中肝细胞内O2•−ATP及HIRI药物的干预效果。更重要的是,UDP成功实现了HIRI过程中小鼠肝脏内O2•−ATP的可视化。最后,本文首次揭示了HIRI过程中细胞内的O2•−—SDH—线粒体内的NADH—线粒体内的ATP—细胞内的ATP级联介导的信号通路。这项工作报道了首个研究HIRI中O2•−ATP之间相关性和协同作用的荧光探针,有望为深入了解HIRI进展中相互联系的活性分子之间的相互作用提供多种机会。

全文链接:https://doi.org/10.1021/jacs.3c04303

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