在全球耕地中，约有30%的土壤存在磷缺乏问题，严重制约作物产量。植物通过复杂的信号网络感知和响应磷酸盐（Pi）饥饿，但其分子机制尚未完全明确。在本次黄进课题组的文献分享会上，由王凌翊（2024级生物技术与工程专业硕士研究生）分享的题为“OsbHLH6 interacts with OsSPX4 and regulates the phosphate starvation response in rice”的文章。该文章发表于The Plant Journal（中科院一区，IF=5.7，第一作者：Qiuju He，通讯作者：Chuanzao Mao）。
一、研究背景：磷饥饿信号中的转录因子与SPX蛋白
磷是植物生长发育必需的宏量元素，其缺乏会激活一系列磷酸盐饥饿响应（PSR）基因的表达。SPX家族蛋白（如OsSPX4）作为负调控因子，在磷充足时抑制核心转录因子OsPHR2的核定位，从而抑制PSR基因表达。然而，是否存在其他转录因子参与SPX介导的磷信号调控，尚不清楚。
二、研究方法：多层次解析bHLH6的功能与机制
研究通过酵母双杂交（Y2H）筛选，以OsSPX4为诱饵，鉴定出与其互作的转录因子OsbHLH6。进一步通过Co-IP、BiFC、亚细胞定位、转录激活实验、基因过表达与突变体构建、RNA-seq等多技术手段，系统解析了OsbHLH6的功能及其与SPX4的遗传互作关系。
三、关键发现：OsbHLH6是磷饥饿诱导的转录因子
表达特性：OsbHLH6在磷饥饿条件下表达被显著诱导，尤其在叶片中表达量上升约6倍；亚细胞定位与转录活性：OsbHLH6定位于细胞核，其N端具有转录激活结构域；表型效应：过表达OsbHLH6导致植株磷积累、PSR基因上调、根毛增长、酸性磷酸酶活性升高，表现出增强的磷饥饿响应。
四、分子机制：OsbHLH6竞争性结合SPX4，释放OsPHR2
特异性互作：OsbHLH6仅与SPX4结合，而不与其他SPX蛋白或OsPHR2相互作用； 更高亲和力：OsbHLH6与SPX4的结合亲和力高于SPX4与OsPHR2，从而竞争性解除SPX4对OsPHR2的抑制；遗传互补：SPX4过表达可逆转OsbHLH6过表达引起的磷积累表型；在spx4突变体背景下，过表达OsbHLH6则无额外效应。
五、功能验证：双突变体揭示遗传上位关系
在spx4突变体背景下进一步突变bhlh6，导致植株磷含量和磷转运基因（OsPT3、OsPT10）表达进一步下降，表明bHLH6在SPX4功能缺失时仍发挥正向调控作用。
RNA-seq分析显示，OsbHLH6过表达与spx4突变体共享大量差异表达基因，这些基因富集于应激响应、小分子代谢、分解代谢等GO类别，进一步证实二者在磷信号通路中的协同作用。
六、研究意义：揭示新型调控模块，提升作物磷效率
该研究首次报道了转录因子通过直接与SPX蛋白互作调控磷信号的新机制，提出了“OsbHLH6–SPX4–OsPHR2”工作模型（图1）：
磷充足时：OsbHLH6与SPX4结合，部分解除对OsPHR2的抑制，同时自身被SPX4滞留于胞质；
磷饥饿时：SPX4降解，OsbHLH6与OsPHR2共同入核激活PSR基因表达。这一发现不仅深化了对植物磷信号网络的理解，也为通过基因编辑或微生物组策略提高作物磷利用效率提供了新的分子靶点和理论依据。
七、课题组启示
本课题组硕士研究生王凌翊目前的研究方向之一为Pi转运蛋白响应植物非生物胁迫机制的解析。对我们的启发有：
技术方法层面：技术方法层面的借鉴：优先进行表达与互作分析，文献中采用的多层次技术手段（如RNA-seq、酵母双杂交Y2H、Co-IP、BiFC等）为我们提供了可借鉴的实验策略，但应用于自身课题时，需遵循“先验证后深入”的原则：初步表达分析：首先使用qRT-PCR或RNA-seq技术，分析E3 ligase基因在低磷条件下的表达变化，以及其突变体对磷响应基因（如OsPHR2、SPX家族、OsbHLH6等）的转录水平影响。只有在观察到显著差异（如我们的E3 ligase基因表达上调/下调或下游基因变化）时，才假设可能与特定通路相关，避免预先绑定OsbHLH6-SPX4-OsPHR2模型。互作蛋白筛选：借鉴Y2H或IP-MS方法，以E3 ligase为诱饵，无偏倚地筛选其互作伙伴（不限于SPX蛋白），从而识别可能的新调控节点。如果初步表达分析显示与SPX4或OsbHLH6有关联，可进一步测试互作，否则优先探索其他候选。动态验证技术：使用BiFC或亚细胞共定位成像，观察目标蛋白在低磷胁迫下的细胞定位变化与互作动态，但应聚焦于自身基因的特性，而非直接复制文献设置。多组学整合：通过RNA-seq或蛋白组学分析目标突变体的全局变化，富集分析GO或KEGG通路，以识别磷响应外的其他机制（如应激响应、代谢途径），确保全面性；
机制层面：目标基因的功能特异性：E3 ligase可能通过泛素化修饰调控蛋白稳定性（如降解抑制子或激活子），而非直接竞争性结合。建议先进行泛素化 assay（如in vitro ubiquitination）或降解实验（如cycloheximide chase），测试E3 ligase对已知磷信号蛋白（包括SPX4）或新底物的影响，但仅当表达分析提示关联时进行。下游靶蛋白筛选：优先使用IP-MS（免疫沉淀-质谱）筛选E3 ligase的底物蛋白，结合CRISPR突变体表型（如磷含量、根形态），鉴定可能的关键因子。如果与OsbHLH6-SPX4-OsPHR2通路无关，则探索其他通路（如激素信号或离子转运）。