本周推荐的文章为7月4日黄进课题组每周的文献分享组会上，由王凌翊（2024级生物技术与工程专业硕士研究生）分享的题为“Phosphate-dependent regulation of vacuolar trafficking of OsSPX-MFSs is critical for maintaining intracellular phosphate homeostasis in rice”的文章。该文章发表于Molecular Plant（中科院一区，IF=24.1，第一作者：Runze Guo，通讯作者：Huixia Shou）

        一、研究背景：液泡储磷的“守门人”如何被调控？

        液泡储存了植物细胞中高达95%的无机磷酸盐（Pi），是细胞内Pi稳态的核心调控者。SPX-MFS家族蛋白（如水稻中的OsSPX-MFS1,2,3）已被证实是液泡的Pi输入转运蛋白（或称为VPTs/PHTs）。有趣的是，水稻最主要的转运蛋白OsSPX-MFS3的基因转录水平对Pi缺乏响应并不强烈，暗示存在转录后调控机制。

        OsSPX-MFS蛋白包含两个关键结构域：感知Pi信号的SPX结构域和负责Pi跨膜转运的MFS结构域。然而，植物如何感知胞内Pi水平并据此精确调控SPX-MFS蛋白的活性（尤其是其定位）以维持Pi稳态，仍有待揭示。

        二、研究方法：多维度追踪蛋白的“转运之旅”

研究团队综合运用了多种技术手段对基因功能、蛋白的定位及互作进行了分析。

细胞生物学定位：利用GFP融合蛋白在原生质体和水稻转基因植株中观察OsSPX-MFSs在不同Pi条件下的亚细胞定位；

蛋白互作筛选与验证：通过酵母双杂交（Y2H）筛选与OsSPX-MFS3互作的蛋白，并利用双分子荧光互补（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）等技术在植物体内外验证互作；

遗传学分析：构建并分析ossyp21、ossyp22基因突变体、OsSYP22显性负突变（OsSYP22-ND）过表达植株、osspx-mfs1/2/3三突变体及其不同结构域（SPX或MFS）互补植株的表型; 

生物化学分析：分离原生质体和液泡膜，通过免疫印迹定量蛋白分布；利用氧化还原敏感型GFP（roGFP2）进行拓扑结构分析；

生理指标测定：测量植株生物量、组织及液泡内Pi浓度（采用体外提取结合孔雀石绿法及活体³¹P-NMR技术）；

计算预测：运用AlphaFold2预测OsSPX-MFS3蛋白及其与OsSYP22复合物的结构。

三、关键发现：Pi浓度如何“指挥”转运蛋白的“泊位”？

Pi缺乏“扣押”转运蛋白于“转运站”（PVCs）： 在Pi充足条件下，OsSPX-MFSs主要定位于液泡膜（tonoplast）; 在Pi缺乏条件下，OsSPX-MFSs向液泡膜的运输被阻断，大量滞留在前液泡区室（PVCs）中，导致定位于液泡膜的比例从~80%急剧下降至~20%。这种滞留显著降低了液泡储存Pi的能力。

四、找到液泡定位的“引航员”——SNARE蛋白OsSYP21/22

酵母双杂交筛选发现并证实了Qa-SNARE蛋白OsSYP21和OsSYP22能与OsSPX-MFS3的MFS结构域特异性互作。OsSYP21/22定位于PVCs和液泡膜，其功能是促进OsSPX-MFS3从PVCs到液泡膜的运输（囊泡融合）。

遗传证据：表达负显性OsSYP22（OsSYP22-ND）会抑制OsSPX-MFS3的液泡膜定位，使其滞留在PVCs，并导致液泡Pi浓度降低至野生型的75%。而过表达正常的OsSYP21/22则提高液泡Pi浓度至130%。

五、SPX结构域——感知Pi的“分子开关”

SPX结构域——感知Pi的“分子开关”

SPX结构域通过其带正电荷的磷酸结合簇（PBC）特异性结合肌醇焦磷酸（如InsP8），直接响应细胞内Pi水平变化：Pi充足时，InsP8结合PBC；Pi缺乏时，SPX处于未结合配体状态。

调控：Pi依赖的OsSPX-MFS3转运开关

1、Pi缺乏下的抑制：

当细胞内Pi不足时，SPX结构域会抑制MFS结构域与液泡膜蛋白OsSYP22的相互作用（BiFC和Co-IP实验证实互作大幅减弱），从而阻断磷酸盐向液泡的转运过程。

2、Pi充足下的激活：

当Pi充足时，InsP8与SPX结合，解除其对MFS的抑制，使MFS能够与OsSYP22互作并定位至液泡膜，实现磷酸盐输入。

3、结构域功能验证：

删除SPX结构域的OsSPX-MFS3（仅保留MFS结构域）在Pi缺乏条件下仍能定位到液泡膜并执行转运功能。互补实验证明：MFS结构域独立负责磷酸盐转运活性，而SPX结构域则专门负责根据Pi水平调控这一过程。

图1  SPX结构域感知细胞内磷水平并调控OsSPX-MFS3转运的潜在机制

        六、课题组启示

        本课题组硕士研究生王凌翊目前的研究方向之一为Pi转运蛋白响应植物非生物胁迫机制的解析。本次分享的水稻OsSPX-MFS感知、调控Pi浓度分子机制的研究对我们的启发包括：

        技术方法：原文中解析蛋白动态定位的多种技术（如活体BiFC互作验证、液泡分步分离与免疫印迹定量）可直接应用于探究磷转运蛋白在低磷胁迫下的亚细胞定位变化及亚细胞水平Pi水平变化（我们需要分析高尔基体内Pi水平的变化）；

        机制启发：我们希望解析生物胁迫条件下Pi信号参与细胞结构变化的机制，即Pi转运蛋白如何通过互作蛋白（分子开关？）及胞内小分子（胞内环境）的影响，进而调控下游相关机制，以提高植物应对非生物胁迫能力的机制。因此，分子开关和胞内特定化学小分子的确定，可能是我们后面要重点突破的两个方向。