蛋白表面不稳定修饰，比如糖基化中的唾液酸化修饰，通过动态调控蛋白表面的化学微环境而影响蛋白的局域结构，从而可能介导目标蛋白的特定功能。然而，由于这类化学修饰天然就存在可变性强、对环境灵敏性高等特点，从分析化学的角度去追踪其背后的分子机制一直缺乏合适的结构分析手段。近日，南开大学李功玉课题组和美国威斯康星大学麦迪逊分校李灵军课题组在美国化学会分析化学顶尖期刊Analytical Chemistry上发表了一篇题为“Native ion mobility-mass spectrometry-enabled fast structural interrogation of labile protein surface modifications at the intact protein level”的文章，通过开发一种非变性非靶向的“双非”离子淌度结构质谱分析技术，快速揭示了唾液酸化修饰调控转铁蛋白构象和拓扑学结构稳定性的分子机制，并初步考察了唾液酸化种类对于转铁蛋白跨膜共转运铁离子和淀粉样蛋白Aβ的影响。【注：李功玉课题组的主要研究方向是蛋白结构质谱分析；李灵军课题组的主要研究方向包括定量神经肽组学、质谱成像分析以及手性神经肽离子淌度质谱分析】
蛋白质唾液酸化与包括阿尔茨海默病(AD)在内的许多疾病密切相关。在广泛使用的抗体药物中，唾液酸化的种类（Neu5Ac vs Neu5Gc）也起着至关重要的药效调控作用。然而，唾液酸化种类如何影响转铁蛋白辅助的铁和Aβ细胞共摄取过程仍缺乏对应的分子证据。本文作者开发了一种基于非变性非靶向离子淌度质谱的快速结构探测方法，可以实现成熟糖蛋白上附着的唾液酸精准、协同和原位操控。在此基础上快速揭示了唾液酸化修饰调控转铁蛋白构象和拓扑学结构稳定性的分子机制，并初步考察了唾液酸化种类对于转铁蛋白跨膜共转运铁离子和淀粉样蛋白Aβ的影响（图1）。细胞毒性实验表明，Neu5Gc取代Neu5Ac增强了转铁蛋白辅助、铁负荷相关的Aβ细胞毒性。非变性凝胶电泳和离子淌度质谱分析表明，唾液酸化能稳定转铁蛋白构象，但抑制其二聚化。总之，本项工作通过开发“双非”结构质谱技术，捕捉到了参与微调AD相关糖蛋白结构微异质性的关键唾液酸化修饰中间体。研究结果不仅揭示了唾液酸化种类调控转铁蛋白结构和功能的分子基础，还表明了维持适度的转铁蛋白唾液酸化水平，特别是Neu5Ac，在促进铁细胞运输和降低铁诱导的Aβ细胞毒性等方面的重要性。
图1. 转铁蛋白辅助的跨膜共转运铁离子和淀粉样蛋白Aβ示意图。图片来源（Li* et al. Anal. Chem. 2022,doi: 10.1021/acs.analchem.1c04503）
图2. 转铁蛋白唾液酸化修饰调控淀粉样蛋白Aβ细胞毒性。图片来源（Li* et al. Anal.Chem. 2022, doi: 10.1021/acs.analchem.1c04503）
由于转铁蛋白主要功能是参与铁稳态，因此作者聚焦到唾液酸化修饰介导铁调控Aβ细胞毒性这个层面上，而这被认为可能与神经退行性疾病的发病机理相关。为了评价在Aβ感染过程中唾液酸化修饰(末端唾液酸化的类型和数量)对转铁蛋白活性的影响，作者在细胞毒性实验中选用了三种类型的转铁蛋白(人源、牛源和小鼠源)。实验结果表明，单独用适量Fe3+培养细胞是无毒的(Group I，图2B)。然而，转铁蛋白超载Fe3+毒性更大一些(Group II, 图2B)。根据细胞存活率数据，含有大量Neu5Gc修饰的小鼠转铁蛋白(细胞存活率为~78%)似乎比含有大量Neu5Ac修饰的人源转铁蛋白(细胞存活率为~88%)负载更多的Fe3+。同时，共转运Aβ42可显著增强转铁蛋白介导的铁超载细胞毒性(GroupIII，图2B)。III组的细胞存活率均低于60%，而不同唾液化程度的hTF、bTF和mTF对共导入的Aβ42的细胞毒性的影响程度各不相同。需要指出的是，Aβ42/铁/TF混合物的细胞毒性是由铁负荷、Aβ42寡聚以及Aβ42与细胞内还原Fe2+的相互作用这三者共同作用的结果。尽管Neu5Ac和Neu5Gc的去唾液酸化作用都能减轻Aβ细胞毒性的负担，但Neu5Ac修饰往往更有利于转铁蛋白维持细胞活力，在积累Aβ细胞毒性方面的影响不如Neu5Gc。
图3. 碰撞诱导解离技术梯度释放唾液酸实验揭示其种类依赖型化学热稳定性。图片来源（Li* et al. Anal. Chem. 2022, doi:10.1021/acs.analchem.1c04503）
非变性非靶向离子淌度结构质谱的核心在于在非变性条件下，通过非靶向全离子去折叠（AIU）和碎裂（AIF）的方式，高通量无损操控蛋白气相结构。“双非”气相解离技术可以跟踪唾液酸化修饰的化学热稳定性（图3），而“双非”气相活化技术可以快速表征构象稳定性（图4）。糖蛋白组学数据明确地确定了人源转铁蛋白的两个N-糖基化位点Asn432和Asn630，其末端仅连接Neu5Ac，并没有Neu5Gc。牛属转铁蛋白同时携带Neu5Ac和Neu5Gc，而小鼠转铁蛋白则富含Neu5Gc，这与之前的文献报道和许多研究结果是一致的。来自非靶向AIF-MS实验的数据集清楚地跟踪了Neu5Ac从人类转铁蛋白中逐渐释放的过程(图3A)，其中总共捕获了四个Neu5Ac残基，由唾液酸化形式F1到F5所示(图3D)。相比之下，牛属转铁蛋白的AIF图像(图3B)显示其唾液酸化修饰为三个Neu5Ac残基和两个Neu5Gc残基 (图3D)。有趣的是，作者发现Neu5Ac对碰撞激活的抵抗能力低于Neu5Gc，这一点可以从Neu5Ac依次优先释放解离，然后Neu5Gc之后才被解离下来的实验结果得出结论(图3B和3E)。令人惊讶的是，从小鼠转铁蛋白中释放单独的Neu5Gc需要比从人源转铁蛋白释放单独的Neu5Ac需要更高的能量，如图3A和3C所示，在120V的情况下，第二个Neu5Ac即将被释放，而Neu5Gc没有被释放。作者进一步绘制了这些唾液酸化异构体随AIF电压变化的趋势线，如图3E所示。这些半定量图进一步证明了不同的唾液酸化释放行为，例如，Neu5Ac的AIF50值为130v，而Neu5Gc的AIF50值大于145v)。由此可见，在转铁蛋白体系中，Neu5Ac的唾液酸化修饰的化学稳定性不如Neu5Gc。这一观察结果为下面对转铁蛋白唾液酸化修饰的构象稳定性分析奠定了重要的化学基础。
图4. 碰撞诱导去折叠技术梯度释放转铁蛋白构象元素实验揭示其种类依赖型构象稳定性。图片来源（Li*et al. Anal. Chem. 2022, doi: 10.1021/acs.analchem.1c04503）
在此基础上，作者将开发的AIU技术用于对差异唾液酸化修饰的转铁蛋白进行构象稳定性分析。如图4所示，虽然在所有的唾液酸化糖蛋白中都存在多次构象转变，但在相同的活化能范围内，这些转铁蛋白会经历不同的去折叠轨迹。根据不同的展开轨迹，可以通过3D分类(图4M-P)很好地分辨出三种转铁蛋白。基于AIU的逐步去折叠轨迹既可以获得构象稳定性信息，又可以通过CIU50和CIU差值图计算均方根偏差(RMSD)进行多种条件之间的定量比较。如图5A，化学结构显示Neu5Ac与Neu5Gc具有较高的相似性。
基于它们各自的逐步去折叠轨迹(图4)，作者首先计算了三个转铁蛋白的CIU50(图5B)和RMSD值(图5C)。图5中的这些观察结果表明，人源转铁蛋白在抵抗外力去折叠方面最稳定，构象灵活性最低。进一步基于CIU50值的定量稳定性分析表明，Neu5Gc修饰的构象稳定性往往不如Neu5Ac修饰。为了进一步评估唾液酸化作用，作者采用去唾液酸化修饰酶处理三种不同的转铁蛋白，并比较溶液中去除唾液酸化前后的构象稳定性。指纹图谱和对应的差异图清楚地表明，Neu5Ac和Neu5Gc唾液酸修饰均能稳定转铁蛋白的构象。进一步的实验数据表明唾液酸化在影响转铁蛋白的去折叠指纹图谱和相关稳定性分析中发挥了重要作用。
图5. 唾液酸化修饰种类依赖型的转铁蛋白拓扑学结构稳定性的分子机制研究。图片来源（Li* et al. Anal.Chem. 2022, doi: 10.1021/acs.analchem.1c04503）
除了对转铁蛋白单体的化学稳定性和构象稳定性的研究外，作者还初步探究了唾液酸化修饰调控转铁蛋白拓扑学稳定性的分子机制。一般认为转铁蛋白二聚可能通过介导大脑铁稳态和Aβ的共导入路径，影响AD的疾病状态。图5D结果显示，随着唾液酸的逐渐释放，人源转铁蛋白和牛转铁蛋白的二聚率都较高，而小鼠转铁蛋白二聚率在整个碰撞活化能量范围内没有明显变化。作者还采用溶液相非变性电泳技术对相关结构进行了确认。结合IM-MS数据和native PAGE数据可以发现，Neu5Ac和Neu5Gc的唾液酸化均会抑制转铁蛋白的二聚，但Neu5Gc的抑制作用不能通过唾液酸化释放而恢复，而Neu5Ac的抑制作用在唾液酸脱离后得以恢复。因此，这些观察结果表明，唾液酸化，特别是Neu5Ac，可以有效地阻止转铁蛋白二聚。
表1. 转铁蛋白唾液酸化修饰的构效关系总结。
| Sialylation Dependency | SA vs DeSAa | Neu5Gc vs Neu5Ac |
| Aβ/Iron/TF Cytotoxicity | SA > DeSA | Neu5Gc > Neu5Ac |
| TF Chemical Stability | N. A.b | Neu5Gc > Neu5Ac |
| TF Conformational Stability | SA > DeSA | Neu5Gc < Neu5Ac |
| TF Dimer Stability | SA < DeSA | N. A. |
a SA,with sialylation; DeSA, without sialylation (de-sialylated).b N. A.,not applicable.
综上所述，如表1所示，作者的数据表明转铁蛋白的表面唾液化修饰增强了铁相关的Aβ细胞毒性，促进铁结合，稳定了转铁蛋白单体的气相构象，同时抑制了转铁蛋白的二聚倾向。考虑到唾液酸化在维持铁稳态中的重要性，Neu5Ac在减缓Aβ细胞毒性方面似乎比Neu5Gc更有优势。Neu5Ac修饰有利于转铁蛋白的构象稳定，这可能有利于理解转铁蛋白单体分子的功能及其分子机制，而且可以辅助解释与构象重排相关的转铁蛋白二聚化过程。值得注意的是，尽管大脑中铁输入的机制尚未被完全证实，文中的结果提供了一些初步证据，表明通过控制Neu5Ac水平来维持转铁蛋白的单体形式(而不是二聚形式)对其功能至关重要。这是因为Neu5Ac组似乎更有利于减缓Aβ细胞毒性，同时在抑制转铁蛋白二聚方面具有最显著的作用，尽管还需要进行进一步的生物学实验来验证这一推测并阐明其在细胞中潜在的生物学途径。
作者整合了非变性非靶向离子淌度结构质谱平台、自底向上的蛋白质组学、非变性电泳实验和细胞实验，对比性阐明了末端唾液酸化Neu5Ac和Neu5Gc的差异性结构调控作用，包括三维空间结构、构象稳定性和二聚化等。本研究结果不仅为唾液酸化调控蛋白结构和功能提供了新的分子证据，而且表明维持Neu5Ac水平在适当水平的抑制剂开发可以作为潜在的治疗策略，以减缓包括AD在内的几种唾液酸化糖蛋白相关疾病的发病进程。最后，本文提出的非变性非靶向“双非”离子淌度结构质谱技术将适用于其它类似的蛋白表面可变修饰的结构解析中，但是亟需解决的问题，也是结构质谱领域面临的两大难题，则是：结构分辨率和环境兼容性。南开大学李功玉课题组从2021年2月成立之初就以解决领域内这两大难题为核心任务，道阻且艰。李功玉课题组诚挚欢迎对蛋白结构和质谱分析相关领域感兴趣、有科研热情的同学加入，all levels are welcome。
本工作得到了美国国家自然科学基金、美国国立卫生研究院、中国国家自然科学基金、南开大学启动基金和国家高层次人才计划的资助。
李惠琳课题组网址
Gongyu Li*, Ashley Phetsanthad, Min Ma, Qinying Yu, Ashita Nair, Zhen Zheng, Kellen DeLaney, Fengfei Ma, Seungpyo Hong and Lingjun Li*. Native ion mobility-mass spectrometry-enabled fast structural interrogation of labile protein surface modifications at the intact protein level. Anal. Chem. 2022, doi: 10.1021/acs.analchem.1c04503.