一步标记和纯化：通过化学选择探针辅助LC - MS加速植物油中FAHFA的检测

J. Agric. Food Chem. 2025

https://doi.org/10.1021/acs.jafc.5c06401

本文开发了一种基于化学选择性探针（SiO2-PP）的高通量定量分析方法，结合液相色谱-质谱（LC-MS），实现了对植物油中痕量脂肪酸羟基脂肪酸酯（FAHFAs）的快速检测和精准定量。

研究背景

研究问题：脂肪酸羟基脂肪酸酯（FAHFAs）是一类新兴的生物活性脂质，在植物油中具有重要的营养价值和功能意义。然而，由于其在植物油中的含量极低且基质复杂，如何实现高灵敏度、高通量的FAHFA检测成为相关领域的关键问题。解决这一问题不仅有助于深入理解FAHFAs的代谢调控机制，还能为植物油的功能评价和质量控制提供科学依据。

研究难点：FAHFAs的痕量存在与植物油基质的复杂性是研究的主要挑战。首先，FAHFAs在植物油中的丰度极低，而甘油三酯等主要成分却占据绝大部分比例，导致信号抑制和干扰严重；其次，传统分析方法如液相色谱-质谱（LC-MS）虽然能够检测FAHFAs，但样品前处理繁琐、耗时长，且难以完全去除基质干扰，限制了方法的灵敏度和效率；最后，FAHFAs的异构体种类繁多，对其进行全面定量分析需要更高的选择性和分辨能力。

文献综述：目前已有多种基于LC-MS的方法被开发用于FAHFAs的检测，但由于上述挑战，这些方法在实际应用中仍存在局限性。近年来，化学选择性探针技术因其能够通过特定化学反应修饰目标分子的功能基团，从而提高检测灵敏度和选择性，逐渐受到关注。该技术已被成功应用于肽段和短链脂肪酸等复杂体系的分析，但在FAHFAs研究领域尚未见报道。此外，FAHFAs作为内源性生物活性脂质，其在人体代谢调节中的作用已得到初步揭示，但其在植物油中的分布特征和浓度水平尚未系统研究，亟需一种高效、可靠的分析平台加以探索。

实验部分

化学试剂与标准品：实验采用47种脂肪酸羟基脂肪酸酯（FAHFA）标准品，分别购自Cayman Chemical、RC ChemTec Co., Ltd. 和 XuKang Medical Science and Technology Co., Ltd.。详细信息见支持信息表S1。试剂包括HPLC级异丙醇（IPA）、二氯甲烷、乙腈（ACN）、二甲基亚砜（DMSO）、丙酮等。探针合成过程中使用了1-炔丙基哌嗪、4-氨基苯硼酸盐酸盐（4-ABBA·HCl）、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺（TBTA）等关键化合物。探针SiO2-PP的制备过程如方案1所示，涉及4-(4-叠氮苯甲酰胺)苯基硼酸（4-ABPBA）的合成及后续修饰。

探针制备：SiO2-PP探针的制备分为三个步骤：首先通过4-叠氮苯甲酸（4-ABA）与4-ABBA·HCl反应生成4-ABPBA；其次将4-ABPBA负载到二醇修饰硅胶（SiO2-diol）上形成叠氮修饰硅胶（SiO2-N3）；最后通过点击化学反应将1-炔丙基哌嗪引入SiO2-N3，得到目标探针SiO2-PP。探针的转化率和载量分别为99%和92.5 ± 13.7 nmol/mg。

样品处理流程：油样经过简单的预处理后，加入SiO2-PP探针进行标记。具体步骤包括在96孔板中依次加入新鲜丙酮、油样、同位素内标、TEA和HATU，室温振荡反应5分钟。随后通过离心分离去除上清液，并用IPA、DMSO和ACN清洗探针。最后用裂解溶剂（DMSO/ACN/H2O/甲酸，20:70:9:1，v/v/v/v）释放标记产物，完成整个样品前处理过程。

方法优化

标记条件优化：通过单变量实验优化了SiO2-PP探针用量、TEA浓度、HATU浓度、反应温度和时间等关键参数。结果显示，探针用量为15 mg时达到最佳效率，且反应在室温下2分钟即可完成，效率超过98%。此外，裂解条件的优化表明，使用200 μL裂解溶剂可实现大于90%的释放效率，RSD小于3.9%。

质谱行为分析：研究了PP-FAHFA衍生物的质谱行为，发现其在正离子模式下同时形成[M + H]+和[M + Na]+两种主要加合物，相对丰度比约为3:1。通过碰撞诱导解离（CID）分析，进一步揭示了[M + H]+和[M + Na]+的特征碎片路径，验证了其在多反应监测（MRM）分析中的适用性。

方法验证：对方法的线性范围、检测限（LOD）和定量限（LOQ）进行了全面验证。结果显示，FAHFAs的校准曲线在3个数量级范围内表现出优异的线性（ranging from 0.05 to 10 ng/mL），R2值均超过0.9964。LOD（S/N ≥ 3）范围为0.0039至0.033 ng/mL，LOQ（S/N ≥ 10）范围为0.013至0.10 ng/mL。

植物油中FAHFAs测定

FAHFAs含量分析：利用SiO2-PP探针辅助LC-MS策略，对47种市售植物油样品中的FAHFAs含量进行了分析。结果表明，橄榄油、花生油、米糠油、芝麻油和小麦胚芽油的总FAHFA含量显著高于其他七种植物油。详细的FAHFA含量数据见支持信息表S6。

优势异构体分布：在47种FAHFA目标中，五种特定区域异构体（10-SAHPA、10-PAHSA、10-OAHSA、9-OAHSA和10-SAHSA）在所有油样中显示出显著的丰度优势。尤其是10-OAHSA在某一橄榄油样品（OO-3）中的浓度高达17.6 μg/g，远高于其他油样。

样品间差异：同一类型植物油样品之间的FAHFA含量差异显著。例如，在四种测试橄榄油样品中，OO-3样品的FAHFA含量约为OO-2样品的100倍。这种变化可能主要归因于食品加工方法的不同。

总体结论

高通量分析方法：本研究开发了一种基于SiO2-PP探针的高效液相色谱-质谱（LC-MS）方法，用于植物油中痕量FAHFAs的高灵敏检测。该方法通过一步标记反应实现了FAHFAs的高效捕获、基质干扰的有效去除和显著信号放大，将样品前处理时间缩短至30分钟。

方法性能：该方法具有高灵敏度（LOD低至0.0039 ng/mL）、优异的回收率（67-124%），并成功应用于13种植物油样品中47种FAHFA异构体的定量分析。分析揭示了橄榄油、花生油和其他油样中五种主要异构体的富集模式。

应用前景：该方法的高通量、快速性和抗基质干扰能力为复杂基质中痕量功能性脂质的分析提供了基础，具有潜在的应用价值，特别是在脂质组学研究中广泛应用于其他食品或生物样品。