N-Heterocyclic Carbenes: Novel Derivatization Reagents for LC-MS Analysis of Aliphatic Aldehydes

https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c06809

Anal. Chem. 2025

本文首次提出将N-杂环卡宾（NHCs）作为衍生化试剂用于脂肪醛的液相色谱-质谱（LC-MS）分析，并开发了一种基于2-甲基-2,5,6,7-四氢吡咯并[2,1-c][1,2,4]三唑-4-氯化物（MTPTC）的高效定量分析策略，成功应用于人体血清中多种脂肪醛的检测。

脂肪醛是脂质过氧化的重要标志物，其含量变化与代谢性疾病密切相关，因此准确测定脂肪醛对评估健康状况和疾病机制具有重要意义。然而，由于脂肪醛本身稳定性差、缺乏发色团和易离子化基团等特性，直接检测存在困难，需要通过化学衍生化来增强其检测性能。

研究难点：传统的席夫碱反应虽广泛用于脂肪醛的衍生化，但其产物容易形成立体异构体，导致液相色谱分离时出现双峰现象，影响定量准确性；此外，席夫碱反应的可逆性可能导致衍生化产物在样品储存和分析过程中降解，进一步增加定量误差。这些局限性使得脂肪醛的高灵敏度和高选择性检测成为技术难题。

近年来，化学衍生化辅助的液相色谱-质谱（LC-MS）技术已成为脂肪醛分析的主流方法，席夫碱反应是其中最常用的方法之一，但相关研究也指出了其固有的局限性。相比之下，N-杂环卡宾（NHCs）因其独特的电子供体特性和高反应活性，在有机合成领域得到了广泛应用，但尚未被引入分析化学领域。本文创新性地将NHCs用作脂肪醛的衍生化试剂，为解决长期存在的分析难题提供了新思路。

研究方法

NHCs作为衍生化试剂的可行性探索：研究选取五种常见的咪唑鎓基NHC前体（EHMTB、DMBI、DCIC、DMIC和MTPTC），评估其在脂肪醛衍生化中的表现。通过计算六碳醛与各种NHC试剂之间的反应自由能（ΔG），发现DMIC（−6.4 kcal·mol−1）和MTPTC（−7.1 kcal·mol−1）具有显著更高的热力学稳定性，而其他三种试剂的衍生产物稳定性较差且易分解。实验结果表明，MTPTC的质谱信号强度明显高于DMIC，因此被选为后续实验的首选衍生化试剂。

MTPTC衍生化条件优化：系统研究了多种因素对MTPTC衍生化的影响，包括反应溶剂、碱催化剂、衍生化试剂用量、温度和时间。结果显示，非质子溶剂（如DMSO、EA、THF和ACN）对反应活性影响较小，但水的存在显著降低了衍生化效率。DBU作为碱催化剂表现出优异的催化效果，当MTPTC与DBU的摩尔比超过2:1时，反应达到平台期。此外，反应在10至40°C范围内5分钟内即可完成。

LC-MS分析方法开发：使用MTPTC作为衍生化试剂，开发了一种基于NHC介导衍生化的LC-MS定量分析策略。该方法包括样品提取、MTPTC衍生化和LC-MRM MS分析。线性范围为2至1000 nM，相关系数超过0.9916。检测限（LODs）和定量限（LOQs）分别为0.42至2.56 pg和1.26至7.69 pg。

实验设计

样品制备：从人血清中提取脂肪醛，将50 μL样品转移至1.5 mL离心管中，加入200 μL乙酸乙酯进行两次提取。合并两次提取的上清液用于MTPTC衍生化。衍生化过程中，向400 μL血清提取物中加入20 μL DBU（8 mM）和20 μL MTPTC（8 mM），30°C孵育5分钟后用氮气流蒸发溶剂，残渣用100 μL ACN/H2O（v/v, 1:1）重新溶解。

LC-MS分析参数：采用Agilent 1290 Infinity II LC系统与Agilent 6546 QTOF质谱仪联用，色谱分离使用Waters Acquity UPLC BEH C18柱，流速为0.4 mL/min，柱温维持在40°C。流动相由含0.1%甲酸的水（溶剂A）和乙腈（溶剂B）组成，并应用梯度洗脱程序。MS全扫描模式下质量范围为m/z 100−1000。

定量分析验证：通过标准曲线验证方法的线性范围、检测限、定量限、基质效应、准确性和精密度。结果表明，方法具有良好的线性关系，LODs和LOQs分别为0.42至2.56 pg和1.26至7.69 pg。基质效应范围为70.4%至105%，日内和日间RSD分别低于19.8%和22.5%，加标回收率范围为75.6%至118%。

结果与分析

MTPTC衍生化产物的稳定性：MTPTC衍生化产物在ACN/水溶液（v/v, 1:1）中4°C储存100小时后，质谱信号强度几乎没有变化，表明这些衍生产物具有极高的稳定性。这对确保分析结果的准确性和可靠性至关重要。

MTPTC衍生产物的色谱行为和MS/MS裂解：在LC分离条件下，MTPTC衍生的脂肪醛在色谱图中呈现清晰的单峰，有效减少了Schiff碱反应中常见的立体异构产物问题。所有MTPTC衍生的脂肪醛在碰撞诱导解离（CID）条件下均观察到m/z 228.3的显著产物离子，对应于MTPTC部分。这种裂解模式有助于在多反应监测（MRM）模式下轻松检测衍生产物。

脂肪醛含量比较：利用开发的方法定量分析了10名健康个体和10名脓毒症患者血清中的八种脂肪醛。结果显示，脓毒症患者血清中戊醛、己醛、辛醛和壬醛的水平显著升高，其浓度范围分别为6.69至83.94 nM和7.56至127.67 nM，这与先前报道的结果一致。

结 论

关键发现：本研究系统地展示了NHCs作为先进衍生化试剂在LC-MS分析脂肪醛中的新应用。MTPTC作为一种代表性NHC，通过快速反应动力学、高选择性和优异的衍生产物稳定性，显著优于传统的Schiff碱方法。开发的协议成功解决了Schiff碱衍生化中固有的双峰伪影问题，提高了定量准确性和方法稳健性。

研究意义：这些发现为生物样品中羰基化合物的分析建立了一个分析框架，扩展了NHCs在分析化学中的应用。特别是，MTPTC衍生化方法在低浓度脂肪醛检测中表现出色，为临床诊断和疾病机制研究提供了有力工具。