iTASO: A Novel Photosensitive Probe for High-Throughput and Selective Submetabolomic Analysis via Flow Injection-Mass Spectrometry
Anal. Chem. 2025, 97, 1495−1499
https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c06108
本团队近期开发了一种新型光敏探针iTASO，并建立了与流动注射质谱(FI-MS)联用的高通量亚代谢组分析策略，显著提高了复杂生物样品中羰基化合物及其他代谢物的检测灵敏度和覆盖范围。
研究背景
代谢组学在揭示生物系统生理和病理状态方面具有重要作用，但现有高通量分析技术（如FI-MS）因缺乏色谱分离过程，常受到离子抑制效应和基质效应的限制，导致检测灵敏度降低和代谢物覆盖不足。开发一种既能提高离子化效率又能有效控制基质效应的新方法，对于推动高通量代谢组学分析技术的发展至关重要。
在无色谱分离的情况下，如何减少过量衍生化试剂进入质谱仪引起的基质效应是一大挑战；同时，某些代谢物缺乏易离子化的基团，导致其在电喷雾电离(ESI)源中难以被有效检测。此外，设计一种既能高效标记目标代谢物又能在紫外光照射下快速释放强信号产物的光敏探针也面临技术难题。
目前，流动注射质谱(FI-MS)因速度快、成本低和操作简单成为高通量代谢组学分析的主要工具，但其应用受限于复杂的基质效应和有限的代谢物覆盖范围。化学衍生化技术通过修饰分析物结构可提高离子化效率，但传统方法需要大量衍生化试剂，且可能引入额外干扰。光酸生成剂(PAGs)因其在特定波长下释放酸的能力，在光刻、3D打印及生物化学领域有广泛应用，但将其应用于质谱分析的研究较少。基于此，本文提出一种基于共轭亚胺磺酸酯结构的新型光敏探针，结合负模式ESI和FI-MS，以实现高灵敏度、低背景噪声的代谢物检测。
研究方法
iTASO探针的化学结构：研究介绍了一类新型光敏MS探针（iTASO-ONH2、iTASO-NH2、iTASO-NHS及iTASO-MAL），这些探针结合FI-MS用于高通量代谢组学分析。iTASO探针包含一个基于共轭亚胺磺酸酯的光敏单元和一个用于选择性代谢物标记的高反应性基团，能够在365 nm光照下高效释放磺酸。
iTASO-ONH2标记与光解性能：以iTASO-ONH2为例，研究了其化学反应性和光解性能。实验选择了7种含羰基的标准物质作为测试分析物，评估了iTASO-ONH2的标记可行性。结果显示，iTASO-ONH2能在20分钟内完成标记反应，标记效率超过98%，且在无紫外线照射下保持稳定6天。
光解过程与产物检测：研究发现，在紫外线点光源照射下，iTASO-ONH2标记的七种产物在ESI+模式下生成四种特征离子，而在ESI-模式下仅观察到一种含有磺酸基团和分析物自身结构信息的光解产物。进一步的MS/MS分析揭示了三种高丰度的特征报告离子，为选择性识别光解产物提供了依据。
实验设计
FI-MS策略的分析性能：研究通过测试5种羰基化合物，评估了iTASO-FI-MS策略的检测灵敏度、过量iTASO试剂的影响、残留效应及动态线性范围。结果表明，这些分析物的检出限（LOD）介于5至31.5 fmol之间，与先前报道的衍生化辅助LC-MS方法相当。增加iTASO-ONH2浓度导致FI-MS检测的光解产物信号强度降低约34%。
样品处理与数据分析：使用粪便基质加标样本评估了iTASO-FI-MS方法的残留效应。连续50次注射后，五个加标的iTASO-ONH2标记羰基化合物的光解产物MS信号保持稳定，相对标准偏差低于8%。此外，该方法在0.1−250 pmol范围内表现出优异的线性，决定系数（R²）超过0.99。
生物样品分析：将iTASO-FI-MS策略应用于慢性睡眠剥夺小鼠（CSD，n=10）和对照小鼠（CON，n=10）的粪便样本分析，成功鉴定出192种潜在羰基化合物，其中37种显著变化。通过商业标准品验证，确认了18种羰基候选物，进一步证实了该方法的准确性。
结果与分析
光敏探针的设计与应用：基于相似概念框架，设计并合成了三种光敏MS探针：iTASO-NH2、iTASO-NHS和iTASO-MAL，分别用于羧基、氨基和巯基代谢物的选择性标记。这些探针在紫外光照射下生成含有磺酸基团的光解产物，其光解机制与iTASO-ONH2一致。这些探针与FI-MS平台具有良好的兼容性，能够实现羧酸、胺和硫醇的高通量检测。
光解效率与在线光解：在611 cm/min的线速度下，使用2W/cm²强度的365 nm点光源照射，iTASO-ONH2标记产物的光解效率超过88%。这一特性使得在线光解成为可能，结合FI-MS检测，实现了高灵敏度和低背景噪声的快速分析。
相对定量分析：通过对收集的粪便样本进行相对定量分析，发现慢性睡眠剥夺小鼠中37种羰基代谢物显著变化。特别是乙偶姻和3-氧代-5#-胆烷酸被确定为显著变化的代谢物，这与肠道功能障碍有关。这些发现表明，睡眠剥夺可能导致肠道中活性氧化物种的积累，改变肠道微生物群并破坏次级胆汁酸代谢。
总体结论
创新性与应用前景：研究开发了一种新型iTASO光敏MS探针，并将其与FI-MS结合，建立了高通量检测策略。该方法利用iTASO-ONH2的快速和选择性标记能力，通过在线光解生成含有磺酸基团的产品，在ESI-模式下实现高灵敏度检测。iTASO-FI-MS策略表现出高灵敏度、强抗基质干扰能力、低残留效应和宽动态范围，检测灵敏度达到fmol级别，与现有衍生化辅助LC-MS方法相当。然而，由于缺乏色谱分离，该方法无法区分异构体。
实际应用与验证：在慢性睡眠剥夺小鼠的粪便样本中检测到192种潜在羰基化合物，其中37种显著变化，验证了该方法的准确性和适用性。此外，合成的三种光敏探针（iTASO-NH2、iTASO-NHS、iTASO-MAL）展示了高选择性和高效的在线光解能力，突显了该方法在亚代谢组分析中的多功能性。这些iTASO探针在其他MS应用中也具有提升灵敏度的潜力，如MALDI MS成像。