Derivatization-Assisted Acoustic Ejection Mass Spectrometry for High-Throughput FAHFA Prescreening
Anal. Chem. 2025
https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c01004
本文开发了一种新型高通量筛选策略DAEMS（衍生化辅助声波喷射质谱法），用于快速预筛选FAHFA分子，显著提升了筛选效率，并首次揭示了食用菌中的氧化型FAHFA物质，为研究FAHFA多样性和代谢提供了新视角。
研究背景
FAHFA（羟基脂肪酸脂肪酸酯）是一类生物活性脂质，具有重要的结构多样性和潜在健康益处，在代谢调节、炎症反应和胰岛素敏感性中发挥关键作用。然而，FAHFA在生物样本中的低丰度（占游离脂肪酸的0.1%至0.001%）及其极性范围广泛（ClogP值从0.26到18.24）的特点，使得其高通量筛选面临巨大挑战。解决这一问题不仅有助于深入理解FAHFA组学，还能为代谢-炎症疾病研究和食品营养功能评估提供重要科学依据。
FAHFA的低丰度特性使其在常规液相色谱-质谱（LC-MS/MS）分析中难以被检测到，而化学标记（如DMED衍生化）虽能提高灵敏度，但短链至长链FAHFA分子极性差异大，导致液相分离条件选择复杂。此外，多反应监测（MRM）模式下四极杆分析仪扫描速度较慢，需多次LC-MS运行才能覆盖大量MRM通道，例如筛查上千个FAHFA分子通常需要20-30次LC-MS运行，耗时约20小时，这极大限制了分析通量。
近年来，化学标记策略（如DMED及其氘代类似物d4-DMED）已被广泛应用于增强FAHFA在电喷雾离子化（ESI）中的离子化效率，从而提升其可检测性。结合LC-MS技术，这些方法已成功检测出上千种中长链FAHFA分子。Hui等进一步将DMED衍生化扩展到短链FAHFA的检测中，鉴定了六种新的短链FAHFA分子。尽管如此，现有方法在分析通量上的局限性仍亟待解决。声波喷射质谱（AEMS）作为一种新兴技术，具备高灵敏度、优异稳定性和快速分析能力（1-3秒/样品），为高效筛选FAHFA提供了全新解决方案。
研究方法
DAEMS策略的设计与实现：研究开发了一种名为DAEMS的高通量筛选策略，该策略结合了化学衍生化和声学喷射质谱技术。通过使用N,N-二甲基乙二胺（DMED）作为衍生化试剂，显著提高了FAHFA的检测灵敏度。实验中，样品在提取后被均分为两份，分别用DMED和d4-DMED标记，并在1分钟内完成衍生化反应。随后，将标记产物混合并使用AEMS技术进行分析，每秒可处理1至3个样品，极大提升了分析速度。
样品前处理优化：为了加速DMED标记过程，研究采用了超声辅助衍生化反应。实验结果显示，10 mM DMED在HATU催化下，1分钟内即可达到95%的衍生化效率。此外，研究还评估了不同溶剂对检测灵敏度的影响，最终确定异丙醇-乙腈-水（2:9:9，v/v/v）为最佳重溶剂，其相对标准偏差约为6.4%，确保了良好的检测稳定性和重复性。
AEMS参数优化：研究详细探讨了OPI流速、喷射体积和MRM转换数等关键参数对AEMS性能的影响。结果表明，0.32 mL/min的OPI流速能够提供稳定的MS信号，而20 nL的喷射体积则在信号强度和数据点密度之间实现了最佳平衡。此外，每次MS采集设置20个MRM转换可在灵敏度和通量之间取得最优折衷。
实验设计
FAHFA衍生化试剂选择：研究对比了四种常见羧酸衍生化试剂（DMED、DEED、DEPD和4-BNMA）的性能，发现DMED-FAHFAs展现了最高的MS响应，因此选定DMED作为FAHFAs的衍生化试剂。这一步骤不仅增强了MS灵敏度，还简化了后续的MRM扫描流程。
多步筛选与验证：研究选取了14种食用菌样品进行初步筛选，共检测到219个潜在FAHFA家族。以Ramaria botrytoides为例，DAEMS策略识别出24个中长链FAHFA家族，其中19个家族与CL-LC-MRM MS方法一致，覆盖率达到83%。然而，由于DAEMS仅使用20 nL的进样体积，导致部分超低丰度FAHFAs无法被检测到，准确率为79%。
氧化型FAHFAs的发现：通过HRMS/MS分析，研究首次在食用菌中发现了氧化型FAHFAs，这些化合物由十八碳二烯酸与二羟基十八烷酸酯化形成，具体结构为FAHFA 18:2/O(FA 18:1(OH)2)。这一发现表明氧化脂类分子可能参与FAHFAs的生物合成，或FAHFAs在体内经历了氧化修饰。
结果与分析
检测灵敏度评估：在优化条件下，研究评估了五种FAHFAs的检测灵敏度，其检出限（LODs）范围为0.13至0.51 μg/L。DMED标记后，检测灵敏度提高了约20倍，达到了与LC-MRM MS相当的水平，足以满足低丰度FAHFAs的筛查需求。
数据处理与分析：研究模拟了2867种潜在FAHFA结构，并生成了相应的MRM转换列表。整个分析流程从样品提取到数据处理仅需约2小时，相较于传统LC-MRM MS方法至少快一个数量级。这种高通量特性使得DAEMS在多样品筛选中具有显著优势。
短链FAHFAs的干扰分析：研究发现，短链FAHFAs可能会受到二羟基不饱和脂肪酸的干扰，这些化合物具有相同的分子量和相似的MS/MS碎裂模式，难以通过HRMS或MRM MS区分。因此，在分析短链FAHFAs时需要特别注意潜在的干扰因素。
总体结论
技术创新性：本研究首次将化学衍生化技术与AEMS技术相结合，开创了脂质高通量筛选的新方法。DAEMS策略能够在不到2小时内完成超过2800种FAHFA候选物的初步筛选，显著提高了分析效率。
科学意义：通过DAEMS策略，研究首次在食用菌中发现了氧化型FAHFAs，揭示了FAHFAs的多样性及其在生物体内的代谢机制。这一发现不仅深化了对FAHFAs的理解，还为相关领域的研究提供了新的视角。
应用前景：DAEMS策略的成功应用为复杂基质中目标物的快速筛选提供了重要工具，同时扩展了AEMS技术的应用范围。未来，该技术有望在代谢组学、食品营养评价等领域发挥更大作用。