2025年12月4日，课题组在植物学知名期刊Journal of Integrative Plant Biology（IF:9.3）发表“Interspecies rice versus Arabidopsis thaliana protein-protein interactome profiling by touch-down overlapping PCR coupled with HiFi long-read sequencing”的研究论文，继上一代技术BIP-seq之后成功研发第二代低成本、高通量鉴定蛋白互作技术—TDOP-seq，并运用于跨物种蛋白互作研究，成功鉴定到水稻和拟南芥的互作蛋白组合7726个，为物种间蛋白互作组研究（模式物种 vs 非模式物种，病原菌 vs 宿主）提供了强有力的技术支持。

蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）是指两个或多个蛋白质结合在一起，通常形成执行细胞基本功能的复合物。自1989年首个蛋白互作鉴定技术酵母双杂交（Y2H）诞生以来，PPI鉴定已成为现代生物学的主要研究内容。然而，经典的PPI鉴定技术（如Y2H，BiFC，Co-IP，GST Pull-down等）局限于单个或少数蛋白的互作关联，通量和效率偏低，亟需开发低成本、高通量的PPI鉴定技术，在蛋白互作组（Protein-protein Interactome）层面绘制蛋白互作网络图谱。此外，大多数已报道的蛋白质相互作用组图谱研究均在特定物种内开展；然而，物种间蛋白质相互作用组分析对于理解宿主-病原体互作，以及将已深入研究的模式生物的功能信息拓展至其他物种具有重大意义。拟南芥和水稻是植物分子生物学中两个最重要的模式物种。尽管如此，相较于拟南芥，水稻仍有很多蛋白功能未被充分解析，通过筛选与拟南芥已知功能蛋白互作的水稻未知功能蛋白，能够推测其生物学功能，进一步加速水稻功能蛋白组研究。

TDOP-seq（Touch-down overlapping PCR coupled with HiFi long-read sequencing）通过集成“库对库（library versus library）”的酵母双杂交，优化的重叠PCR及PacBio三代测序3个策略来实现PPI的高通量鉴定。“库对库”酵母双杂交可以快速获得随机的阳性PPI互作组合酵母克隆。TDO- PCR则以酵母克隆的裂解产物为模板，巧妙地利用了不同引物的退火温度和浓度差异，实现互作蛋白组合的“猎物”和“诱饵”蛋白基因的cDNA“缝合”。TDO-PCR的前10个循环采用高退火温度，利用低浓度的Br+Bf和Pr+Pf引物实现“猎物”和“诱饵”蛋白基因的cDNA的富集扩增；后20个循环退火改为低退火温度，使得低Tm值的TDOf+TDOr引物温度匹配，且浓度也存在竞争优势，进而驱动重叠PCR反应，将“猎物”和“诱饵”的cDNA无缝拼接成一个完整片段。整个PCR反应中的退火温度设置还引入了Touch-down策略，有效提升了扩增效率（图1A-3）。相较于传统的重叠PCR方法，TDO-PCR可在一个PCR管中一次性完成所有反应，在扩增时间上节省了3倍之多。最终，可将数万这样的扩增产物混合并进行高通量的三代测序，其中同一读长中相连的cDNA序列即源自同一个蛋白相互作用（PPI）阳性的酵母菌落，从而可被直接判定为互作蛋白对。

白互作组研究的利器。尤为重要的是，本研究成功鉴定到水稻和拟南芥的互作蛋白组合7726个，并通过已知的拟南芥蛋白功能，成功预测并验证了多个此前功能未知的水稻蛋白的功能，充分展示了跨物种PPI网络在填补非模式物种的蛋白组学知识空白方面的巨大潜力与应用价值。这项突破性技术不仅将极大加速基础生命科学中的蛋白质相互作用发现，也为系统生物学、宿主-病原体互作研究及作物遗传改良提供了强大的技术支持。此外，TDOP技术不仅仅适用于物种间蛋白互作组的研究，还适用于不同的物种内、不同杂交技术系统（如细菌双杂交、酵母单杂交）等不同场景，具有重大的应用价值。

图1. TDOP-seq的工作流程及其生物信息学分析

中国水稻研究所侯雨萱副研究员和张健研究员为该论文的通讯作者，中国水稻研究所助理研究员黄捷、特聘副研究员程宇以及中国水稻研究所与杭州师范大学联合培养硕士研究生阮静为该论文的共同第一作者。杭州师范大学薛大伟教授及华中农业大学张建伟教授为本研究作出了重要贡献。该工作得到农业生物育种国家科技重大专项（2023ZD04066）、国家重点研发项目（2024YFF1000600）、国家自然科学基金项目（32472115, U22A20456 和 W2412006）、浙江省自然科学基金重大项目（LD24C130001）、浙江省自然科学基金项目（LQN25C130011和 LY23C130004）、以及中国农业科学院农业科技创新工程的资助。同时，该工作也得到水稻生物育种全国重点实验室仪器共享平台和作物遗传改良国家重点实验室高性能计算平台的支持。