图1. Journal of American Society for Mass Spectrometry期刊封面
性激素在生命调节中起到了至关重要的作用，即使痕量性激素也具有很强的生物活性。人体血清中的性激素常常被用于孕产妇健康诊断、新生儿筛查，以及评估骨质疏松、多囊卵巢综合征等代谢疾病，前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌等高危癌症的重要生物标记物，在临床诊断和病理研究中受到了广泛关注。人体血清成分复杂，基质干扰物多，且性激素含量很低，给临床分析带来了诸多阻力。目前常见的血清性激素检测方法是免疫分析法（IAs），例如放射免疫分析（RIA）、酶联免疫吸附法（ELISA）、化学发光免疫分析法（CLIA）等。然而免疫分析法特异性较差，会出现假阳性的检测结果，不同实验室或不同检测方法之间的分析测试结果会存在较大偏差，且不能满足同时测定多种物质的检测需求，通常一次测试只能提供一种性激素的信息。质谱分析方法因其较高的灵敏度和特异性优势，已成为血清性激素检测的重要方法。但由于性激素是典型的弱极性化合物，沸点较高，不易挥发，且血清基质复杂，含有丰富的蛋白质和各种小分子干扰物，会产生较强的基质效应，影响质谱定量的灵敏度和准确性。且目前常用的色质联用技术还需要较长的色谱分离时间，样品测试耗时较久，无法满足现代分析化学快速、高效的要求。因此建立一种快速、准确、高通量的血清性激素定量方法至关重要。
图2. 使用Leidenfrost效应辅助的热解析大气压光电离质谱（LPTD-APPI-MS）和液质联用（LC-APCI-MS） 方法分别建立对于人体血清中游离态的（a）孕酮（progesterone）、（b）雌二醇（estradiol）、 （c）雌三醇（estriol）和（d）雄烯二酮（androstenedione）的标准加入法定量标准曲线
本工作使用大气压光电离质谱（APPI-MS），相对于常规电喷雾质谱（ESI-MS）而言，抗基质效应的能力更强，且对待测物没有极性歧视，对性激素有更高的检测灵敏度。同时本工作设计了一种特殊的样品解析装置，利用Leidenfrost效应，萃取后的血清样品液滴接触高温加热的样品解析装置后，将会在液滴和炙热表面之间产生溶剂蒸汽层，这层溶剂蒸汽可以阻隔热量传递，有效地防止液体飞溅和炸裂。直到溶剂蒸发完全，样品液滴中的性激素分子才被立即释放，从而实现了性激素的浓缩富集，可以进一步地提高检测的速度和灵敏度。与传统的 LC-MS 分析方法方法动辄十几分钟或半个小时的检测时间相比，本工作无需衍生化和色谱分离，大大缩短了分析检测时间，对于性激素标准品，一次测试所需的时间不超过1 min，即使受到基质效应的影响，血清基质中的性激素的测试时间也只需大约2 min，为血清中游离态性激素的快速、高通量分析提供了可能。除此之外，本方法拥有更高的定量灵敏度和准确性，对于性激素标准品的检测限均在 fg/mL 水平， 即使受基质效应的影响，血清中游离态性激素的检测限和定量限也均在 ppt 水平。由于质谱的高特异性优势，本方法可以针对生理活性更强、含量更低的游离态性激素进行精准定量。相对于免疫分析法，避免了交叉反应的干扰，几乎没有假阳性结果产生。
图3. （a）分别使用Leidenfrost效应辅助的热解析大气压光电离质谱（LPTD-APPI-MS）和液质联用（LC- APCI-MS）两种方法对人体血清中的内源性游离态雌二醇（estradiol）、 雌三醇（estriol）和雄烯二酮（androstenedione）的定量结果比较；（b）左侧：分别使用化学发光免疫分析法（CLIA）、 LPTD-APPI-MS 和 LC-APCI-MS 三种分析方法定量人体血清中的内源性孕酮（endogenous progesterone）的结果比较，右侧：分别使用以上三种分析方法定量在人体血清基质中所添加的孕酮标准品（standard progesterone）的浓度结果比较；CLIA和LC- APCI-MS 方法对应的每个数据点均为三次重复实验的平均值，LPTD-APPI-MS 方法对应的每个数据点均为五次重复实验的平均值
本工作将Leidenfrost效应辅助的热解析大气压光电离质谱方法（LPTD-APPI-MS）应用于处于不同生理阶段的女性血清中的游离态性激素的浓度监测，展示出了强大的临床应用价值。通过统计分析发现LPTD-APPI-MS方法的定量结果与液质联用（LC-APCI-MS）方法有很高的相关一致性，且血清中的游离态孕激素、雌性激素和雄性激素随着不同生理阶段的变化 趋势也与前人报道相类似。LPTD-APPI-MS 方法为游离态性激素的临床检测提供了高准确性和高灵敏度的分析测试平台，同时也为大量临床生物样品中生物标志物的快速筛查提供了可能。
图4. 处于（a）未孕（unpregnancy）、（b）孕早期（first trimester）、（c）孕中期（second trimester）和（d）孕晚期（third trimester）这四种不同生理阶段的女性血清中的内源性游离态性激素浓度的箱线图，每一个方格中均包含了中位数、平均值、四分位范围以及第五分位和第九十五分位的数据；LPTD-APPI-MS 和 LC-APCI-MS 两种方法测试血清中游离态性激素的定量结果之间的相关性分析：（e）孕酮（progesterone），（f）雌二醇（estradiol），（g） 雌三醇（estriol），（h）雄烯二酮（androstenedione）
该工作得到了国家自然科学基金、中科院重点技术人才计划及中国国家重点技术人才基金的支持。
论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jasms.2c00077
