Smooth muscle cell (SMC) heterogeneity plays an important role in vascular remodeling, a life-threatening hallmark of many vascular diseases. However, the characterization of SMCs at the single-cell level is stymied by drawbacks of contemporary single-cell protein measurements, including antibody probe cross-reactivity, chemical fixation artifacts, limited isoform-specific probes, low multiplexing and difficulty sampling cells with irregular morphologies. To scrutinize healthy vessels for subpopulations of SMCs with proliferative-like phenotypes, we developed a high-specificity, multiplexed single-cell immunoblotting cytometry tool for unfixed, uncultured primary cells. We applied our assay to demonstrate maturation stage profiling of aortic SMCs freshly isolated from individual mice. After ensuring unbiased sampling of SMCs (80–120 μm in length), we performed single-SMC electrophoretic protein separations, which resolve protein signal from off-target antibody binding, and immunoblotted for differentiation markers α-SMA, CNN-1 and SMMHC (targets ranging from 34 kDa to 227 kDa). We identified a subpopulation of immature-like SMCs, supporting the recently-established mechanism that only a subset of SMCs is responsible for vascular remodeling. Furthermore, the low sample requirements of our assay enable single-mouse resolution studies, which minimizes animal sacrifice and experimental costs while reporting animal-to-animal phenotypic variation, essential for achieving reproducibility and surmounting the drawbacks of pooling primary cells from different animals.

中文翻译：

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小鼠之间的平滑肌细胞成熟异质性变化。

平滑肌细胞（SMC）的异质性在血管重塑中起着重要作用，血管重塑是威胁许多血管疾病的生命特征。然而，单细胞水平的SMCs表征受当代单细胞蛋白质测量的缺点的困扰，包括抗体探针的交叉反应性，化学固定伪影，有限的同工型特异性探针，低多重性和难于采样具有不规则形态的细胞。为了检查健康的血管中是否具有增殖样表型的SMC亚群，我们针对未固定，未培养的原代细胞开发了一种高特异性，多路复用的单细胞免疫印迹细胞仪工具。我们应用我们的测定方法来证明从各个小鼠新鲜分离的主动脉SMC的成熟阶段分析。确保对SMC（长度为80-120μm）进行无偏取样后，我们进行了单SMC电泳蛋白质分离，该蛋白质分离来自脱靶抗体结合的蛋白质信号，并进行了免疫印迹以区分分化标记α-SMA，CNN-1和SMMHC（靶标范围从34 kDa到227 kDa）。我们确定了一个未成熟的SMC的亚群，支持了最近建立的机制，即仅一部分SMC负责血管重塑。此外，我们测定的样品需求量低，因此可以进行单小鼠分辨率研究，从而最大程度地减少动物牺牲和实验费用，同时报告动物之间的表型变异，这对于实现可重复性和克服合并来自不同动物的原代细胞的弊端至关重要。并免疫印迹分化标记物α-SMA，CNN-1和SMMHC（目标范围从34 kDa到227 kDa）。我们确定了一个未成熟的SMC的亚群，支持了最近建立的机制，即仅一部分SMC负责血管重塑。此外，我们测定的样品需求量低，因此可以进行单小鼠分辨率研究，从而最大程度地减少动物牺牲和实验费用，同时报告动物之间的表型变异，这对于实现可重复性和克服合并来自不同动物的原代细胞的弊端至关重要。并进行免疫印迹以识别分化标记α-SMA，CNN-1和SMMHC（目标范围从34 kDa到227 kDa）。我们确定了一个未成熟的SMC的亚群，支持了最近建立的机制，即仅一部分SMC负责血管重塑。此外，我们测定的样品需求量低，因此可以进行单小鼠分辨率研究，从而最大程度地减少动物牺牲和实验费用，同时报告动物之间的表型变异，这对于实现可重复性和克服合并来自不同动物的原代细胞的弊端至关重要。支持最近建立的机制，即仅一部分SMC负责血管重塑。此外，我们测定的样品需求量低，因此可以进行单小鼠分辨率研究，从而最大程度地减少动物牺牲和实验费用，同时报告动物之间的表型变异，这对于实现可重复性和克服合并来自不同动物的原代细胞的弊端至关重要。支持最近建立的机制，即仅一部分SMC负责血管重塑。此外，我们测定的样品需求量低，因此可以进行单小鼠分辨率研究，从而最大程度地减少动物牺牲和实验费用，同时报告动物之间的表型变异，这对于实现可重复性和克服合并来自不同动物的原代细胞的弊端至关重要。