Bloodstream infection is a significant clinical problem, particularly in vulnerable patient groups such as those undergoing chemotherapy and bone marrow transplantation. Clinical diagnostics for suspected bloodstream infection remain centered around blood culture (highly variable timing, in the order of hours to days to become positive), and empiric use of broad-spectrum antibiotics is therefore employed for patients presenting with febrile neutropenia. Gram-typing provides the first opportunity to target therapy (e.g., combinations containing vancomycin or teicoplanin for Gram-positives; piperacillin–tazobactam or a carbapenem for Gram-negatives); however, current approaches require blood culture. In this study, we describe a multiplexed microsphere-PCR assay with flow cytometry readout, which can distinguish Gram-positive from Gram-negative bacterial DNA in a 3.5 h time period. The combination of a simple assay design (amplicon-dependent release of Gram-type specific Cy3-labeled oligonucleotides) and the Luminex-based readout (for quantifying each specific Cy3-labeled sequence) opens opportunities for further multiplexing. We demonstrate the feasibility of detecting common Gram-positive and Gram-negative organisms after spiking whole bacteria into healthy human blood prior to DNA extraction. Further development of DNA extraction methods is required to reach detection limits comparable to blood culture.

中文翻译：

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开发用于人血样本中细菌的无培养物检测和革兰氏分型的多重微球PCR的开发

血流感染是一个重要的临床问题，尤其是在易受伤害的患者群体中，例如接受化学疗法和骨髓移植的患者。对于可疑的血流感染，临床诊断仍以血培养为中心（时间变化很大，数小时至数天变为阳性），因此对于发热性中性粒细胞减少症患者，经验性使用广谱抗生素。革兰氏分型术为靶向治疗提供了第一个机会（例如，革兰氏阳性药中含有万古霉素或替考拉宁的组合；革兰氏阴性菌中哌拉西林-他唑巴坦或碳青霉烯的组合）；然而，当前的方法需要血液培养。在这项研究中，我们描述了具有流式细胞仪读数的多重微球PCR检测方法，它可以在3.5小时内将革兰氏阳性细菌DNA与革兰氏阴性细菌DNA进行区分。简单的测定设计（革兰氏型特异性Cy3标记的寡核苷酸依赖于安普顿的释放）和基于Luminex的读数（用于量化每个特定Cy3标记的序列）的结合为进一步的多重化提供了机会。我们证明了在将完整细菌掺入健康的人血中然后提取DNA之前，检测常见的革兰氏阳性和革兰氏阴性生物的可行性。需要进一步开发DNA提取方法，以达到与血液培养相当的检测极限。简单的测定设计（革兰氏型特异性Cy3标记的寡核苷酸依赖于安普顿的释放）和基于Luminex的读数（用于量化每个特定Cy3标记的序列）的结合为进一步的多重化提供了机会。我们证明了在将完整细菌掺入健康的人血中然后提取DNA之前，检测常见的革兰氏阳性和革兰氏阴性生物的可行性。需要进一步开发DNA提取方法，以达到与血液培养相当的检测极限。简单的测定设计（革兰氏型特异性Cy3标记的寡核苷酸依赖于安普顿的释放）和基于Luminex的读数（用于量化每个特定Cy3标记的序列）的结合为进一步的多重化提供了机会。我们证明了在将完整细菌掺入健康的人血中然后提取DNA之前，检测常见的革兰氏阳性和革兰氏阴性生物的可行性。需要进一步开发DNA提取方法，以达到与血液培养相当的检测极限。