Although kinases are important regulators of many cellular processes, measuring their activity in live cells remains challenging. We have developed kinase translocation reporters (KTRs), which enable multiplexed measurements of the dynamics of kinase activity at a single-cell level. These KTRs are composed of an engineered construct in which a kinase substrate is fused to a bipartite nuclear localization signal (bNLS) and nuclear export signal (NES), as well as to a fluorescent protein for microscopy-based detection of its localization. The negative charge introduced by phosphorylation of the substrate is used to directly modulate nuclear import and export, thereby regulating the reporter's distribution between the cytoplasm and nucleus. The relative cytoplasmic versus nuclear fluorescence of the KTR construct (the C/N ratio) is used as a proxy for the kinase activity in living, single cells. Multiple KTRs can be studied in the same cell by fusing them to different fluorescent proteins. Here, we present a protocol to execute and analyze live-cell microscopy experiments using KTRs. We describe strategies for development of new KTRs and procedures for lentiviral expression of KTRs in a cell line of choice. Cells are then plated in a 96-well plate, from which multichannel fluorescent images are acquired with automated time-lapse microscopy. We provide detailed guidance for a computational analysis and parameterization pipeline. The entire procedure, from virus production to data analysis, can be completed in ∼10 d.

中文翻译：

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使用易位报道分子对单细胞中激酶活性进行活细胞测量。

尽管激酶是许多细胞过程的重要调节剂，但测量其在活细胞中的活性仍然具有挑战性。我们已经开发了激酶易位报道分子（KTR），可以在单细胞水平上对激酶活性的动力学进行多重测量。这些KTR由工程改造的构建体组成，在该构建体中，激酶底物与二聚核定位信号（bNLS）和核输出信号（NES）融合，并与荧光蛋白融合，用于基于显微镜的定位检测。由底物的磷酸化引入的负电荷用于直接调节核的进出口，从而调节报告基因在细胞质和细胞核之间的分布。KTR构建体的相对细胞质相对于核荧光（C / N比）用作活的单细胞中激酶活性的代表。通过将多个KTR与不同的荧光蛋白融合，可以在同一细胞中对其进行研究。在这里，我们提出了一个协议，以执行和分析使用KTR的活细胞显微镜实验。我们描述了新的KTRs的发展策略和在所选细胞系中KTRs的慢病毒表达的程序。然后将细胞铺板在96孔板中，通过自动延时显微镜从该孔中获取多通道荧光图像。我们为计算分析和参数化管道提供了详细的指导。从病毒生产到数据分析的整个过程可以在大约10天内完成。通过将多个KTR与不同的荧光蛋白融合，可以在同一细胞中对其进行研究。在这里，我们提出了一个协议，以执行和分析使用KTR的活细胞显微镜实验。我们描述了新的KTRs的发展策略和在所选细胞系中KTRs的慢病毒表达的程序。然后将细胞铺板在96孔板中，通过自动延时显微镜从该孔中获取多通道荧光图像。我们为计算分析和参数化管道提供了详细的指导。从病毒生产到数据分析的整个过程可以在大约10天内完成。通过将多个KTR与不同的荧光蛋白融合，可以在同一细胞中对其进行研究。在这里，我们提出了一个协议，以执行和分析使用KTR的活细胞显微镜实验。我们描述了新的KTRs的发展策略和在所选细胞系中KTRs的慢病毒表达的程序。然后将细胞铺板在96孔板中，通过自动延时显微镜从该孔中获取多通道荧光图像。我们为计算分析和参数化管道提供了详细的指导。从病毒生产到数据分析的整个过程可以在大约10天内完成。我们描述了新的KTRs的发展策略和在所选细胞系中KTRs的慢病毒表达的程序。然后将细胞铺板在96孔板中，通过自动延时显微镜从该孔中获取多通道荧光图像。我们为计算分析和参数化管道提供了详细的指导。从病毒生产到数据分析的整个过程可以在大约10天内完成。我们描述了新的KTRs的发展策略和在所选细胞系中KTRs的慢病毒表达的程序。然后将细胞铺板在96孔板中，通过自动延时显微镜从该孔中获取多通道荧光图像。我们为计算分析和参数化管道提供了详细的指导。从病毒生产到数据分析的整个过程可以在大约10天内完成。