Engineered polymerases that can copy genetic information between DNA and xeno-nucleic acids (XNA) hold tremendous value as reagents in future biotechnology applications. However, current XNA polymerases function with inferior activity relative to their natural counterparts, indicating that current polymerase engineering efforts would benefit from new benchmarking assays. Here, we describe a highly parallel, low-cost method for measuring the average rate and substrate specificity of XNA polymerases in a standard qPCR instrument. Our approach, termed polymerase kinetic profiling (PKPro), involves monitoring XNA synthesis on a self-priming template using high-resolution melting (HRM) fluorescent dyes that intercalate into the growing duplex as the template strand is copied into XNA. Since changes in fluorescence are directly proportional to XNA synthesis, quantitative measurements are obtained by calibrating the fluorescent signal against chemically synthesized standards. Using PKPro, we discovered that XNA polymerases function with rates of ∼1–80 nt/min and exhibit substrate specificities of ∼0.1–5-fold for xNTP versus dNTP. Last, we show how PKPro could be used in a highly parallel screen by analyzing 288 different polymerase reaction conditions. On the basis of these results, we suggest that PKPro provides a powerful tool for evaluating the activity of XNA polymerases.

中文翻译：

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评价实验室进化的XNA聚合酶的速率和底物特异性

可以在DNA和异种核酸（XNA）之间复制遗传信息的工程聚合酶作为试剂在未来的生物技术应用中具有巨大的价值。但是，当前的XNA聚合酶相对于其天然对应物的功能较差，这表明当前的聚合酶工程学工作将从新的基准分析中受益。在这里，我们描述了一种用于测量标准qPCR仪器中XNA聚合酶平均速率和底物特异性的高度并行，低成本的方法。我们的方法称为聚合酶动力学分析（PKPro），涉及使用高分辨率熔解（HRM）荧光染料在自启动模板上监测XNA合成，该荧光染料插入到正在生长的双链体中，随着模板链被复制到XNA中。由于荧光的变化与XNA合成成正比，因此可以通过根据化学合成的标准品校准荧光信号来获得定量测量结果。使用PKPro，我们发现XNTP聚合酶与dNTP相比，XNA聚合酶的功能速率约为1–80 nt / min，底物特异性约为0.1–5倍。最后，我们通过分析288种不同的聚合酶反应条件，展示了如何在高度平行的筛选中使用PKPro。根据这些结果，我们建议PKPro提供了一个强大的工具，可以评估XNA聚合酶的活性。xNTP相对于dNTP的1-5倍。最后，我们通过分析288种不同的聚合酶反应条件，展示了如何在高度平行的筛选中使用PKPro。根据这些结果，我们建议PKPro提供了一个强大的工具，可以评估XNA聚合酶的活性。xNTP相对于dNTP的1-5倍。最后，我们通过分析288种不同的聚合酶反应条件，展示了如何在高度平行的筛选中使用PKPro。根据这些结果，我们建议PKPro提供了一个强大的工具，可以评估XNA聚合酶的活性。