细胞内第二信使cAMP及其依赖性激酶PKA可以转导来自数百种G蛋白偶联受体（GPCR）的信号，调节细胞的新陈代谢、生长和存活以及非常多的生理功能【1-3】。由此引出了一个科学问题：cAMP-PKA是如何应对这么多种信号转导的功能？PKA由一对催化（PKA-C）亚基组成，与二聚体调控亚基（RIα, RIβ, RIIα, RIIβ）中的一个结合形成R:C复合物，而A激酶锚定蛋白（AKAPs）则将PKA全酶招募到整个细胞的信号离散区【4-7】。有研究发现普遍表达的RIα亚基在细胞中通过液液相分离（LLPS）形成生物大分子凝聚物，并且受到了cAMP水平动态变化的影响，可以有效的封存高浓度cAMP【8】。破坏RIα的LLPS也会损害磷酸二酯酶（PDE）介导的局部cAMP降解，影响cAMP-PKA信号的正常转导【9】。因此，RIα的LLPS似乎在驱动cAMP分隔和特异性信号转导方面发挥关键作用，然而RIα形成生物大分子凝聚物的分子基础和招募PKA-C的功能仍不清楚。近日，来自美国加州大学圣地亚哥分校的Jin Zhang课题组在Mol Cell上发表了研究论文Molecular determinants and signaling effects of PKA RIα phase separation。在本研究中，作者通过对RIα形成生物大分子凝聚物的结构进行分析，揭示了在LLPS形成过程中发挥作用的分子基础，并调控cAMP在细胞质中的浓度分区。并且还发现了在凝聚物中存在着一种非典型的PKA-C和RIα结合，该结合对于维持PKA-C在细胞中的活性也非常重要。该研究揭示了RIα凝聚物在驱动信号特异性方面的功能多样性。先前的研究发现RIα的N端的D/D结构域对于LLPS的形成至关重要，该区域在两个亚基之间形成一个反平行的二聚体界面，同时还负责与AKAP的结合。作者在此深入研究这两种功能是否以及如何对RIα的LLPS起作用。有人认为RIα的50位L突变为R将破坏其二聚体的形成，而作者的研究发现L50R单位点的突变足以破坏LLPS的形成。当共表达AKAP时，野生型（WT）的RIα也不能诱导形成LLPS，这说明RIα结合AKAP的功能将破坏其自身LLPS的形成。进一步的研究发现，AKAP是通过自身的AKB结构域结合RIα从而破坏RIα二聚体的形成，这些结果表明，RIα的D/D结构域完全通过二聚体驱动LLPS的形成，而RIα的LLPS和AKAP-RIα的锚定是cAMP/PKA通路中不同的空间区隔形式。对RIα的结构分析表明，cAMP调控蛋白CNB结构域的N3A基序在RIα异构体中形成了一个独特的二级二聚体界面。作者的研究发现突变与CNB结构域结合的RIα中Y122位点会干扰二聚化以及LLPS的形成，这表明RIα与其他调控蛋白的多个相互作用位点都可以驱动RIα的LLPS。由于cAMP在调节RIα的LLPS方面起着关键作用，cAMP与RIα的结合需要CNB结构域介导，而CNB-A比CNB-B的效率高出50倍，作者接下来分析不同CNB结构域调控cAMP-RIα结合的分子基础。结构分析表明，RIα的E202和R211残基形成关键的氢键协调CNB-A与cAMP结合，而E326和R335残基形成的氢键负责调控CNB-B与cAMP的结合。对E202或E326位点进行突变，都可以破坏RIα的LLPS形成，这表明cAMP调控RIα的LLPS需要与两个CNB结构域结合。在之前的研究中，作者发现PKA-C在体外可以抑制RIα的LLPS形成，因此他们提出了一个假说模型：RIα的LLPS形成需要释放PKA-C。为了进一步解释这一模型的可靠性，作者对负责与PKA-C结合的RIα Linker区域进行结构分析。当与PKA-C结合时，Linker区内的抑制序列（IS）被埋藏在PKA-C活性位点裂隙附近，cAMP与两个CNB结构域的结合会诱导构象发生变化，从而在异构体上释放PKA-C，增加Linker的暴露。当突变IS中的A99为S时，将诱导RIα的自磷酸化，可以增强cAMP诱导的RIα和PKA-C解离，并暴露Linker区域，从而也促进了RIα凝聚物的形成。这些数据支持了作者提出的模型，即通过从R:C复合物中释放PKA-C，可以暴露Linker区域从而驱动LLPS的形成。在高浓度cAMP条件下可以观察到PKA-C与RIα凝聚物的结合，同时还能检测到凝聚物中PKA的高活性，这与上述的发现存在矛盾之处。因此在文章的最后，作者对该现象进行了研究。作者认为可能存在着非典型的R:C复合物存在于RIα凝聚物中，通过FRAP和FLIM-FRET发现RIα凝聚物中PKA-C与RIα的结合，同时还发现IS在形成活跃的非典型R:C复合物中的关键作用。而通过非典型R:C复合物进行的PKA-C招募是RIα凝聚物中高PKA活性的原因，IS序列的突变将破坏RIα凝聚物中PKA的活性，导致细胞质中基础PKA活性的增加。总的来说，这篇文章详细探讨了RIα形成LLPS的分子基础及其功能，LLPS的形成需要依赖自身二聚化以及与其他调控蛋白和cAMP的结合，同时发现了一个非典型R:C复合物的存在，该复合物使RIα凝聚物能够抑制细胞膜PKA的活性，防止异常的信号转导，维持适当的细胞内信号传递对细胞的健康和功能至关重要。https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.03.002制版人：十一
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