唐功利团队Nat. Commun.：GyrI-like蛋白通过其环丙基水解活性实现细胞保护功能

微生物对抗生素的抗性是一种古老的自然现象，它的出现远远早于人类对抗生素的使用。临床上使用的抗生素有相当一部分是由微生物发酵产生的，这些微生物需要进化出对应的抗性基因来保护自己免受所产生抗生素的伤害（自抗性）。这些抗性基因在不同微生物间的水平转移导致多药耐药菌、甚至泛耐药菌变得越来越普遍。因此，对抗生素的生物合成与自抗性机制的研究将有助于人们对抗性基因的产生、进化以及转移得到深入的认识和理解。

中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室的唐功利（点击查看介绍）课题组多年来一直致力于对结构独特、活性显著的复杂天然产物进行生物合成和自抗性机制研究，从酶催化反应的角度理解自然界神奇的化学反应和生理性拮抗的生化/化学本质，属于典型的有机化学-微生物学-生物化学-天然产物药学的交叉学科，对于天然产物药物研究中重点关注新结构的发现、创造和复杂化合物的高效制备均具有重要的推动作用。

以谷田霉素（YTM）和CC-1065为代表的苯并二吡咯生物碱家族抗肿瘤抗生素的生物合成和自抗性机制研究则集中体现了上述思想。该家族的天然产物是一类来源于微生物、含有环丙烷药效团的高活性天然产物，目前包括YTM、CC-1065和多卡霉素。这些化合物主要是对细胞内的遗传物质DNA进行烷基化修饰，从而达到杀死细胞的目的（IC₅₀为pM级）。研究表明这类化合物是靶向治疗中理想的“弹头”，例如，由多卡霉素衍生的抗体药物偶联分子MDX-1203已进入临床一期，主要治疗非霍奇金淋巴瘤和肾细胞癌。唐功利课题组前期克隆了YTM（J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 8831）和CC-1065（ACS Chem. Biol., 2017, 12, 1603）的生物合成基因簇，并发现DNA糖苷酶YtkR2可以将由YTM烷基化引起的损伤碱基移除，从而开启DNA的一系列修复机制（Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51, 10532）。

最近，唐功利研究团队在该家族天然产物的自抗性机制研究方面再获新突破。该团队从YTM研究材料出发，证明了YtkR7（属于GyrI-like家族蛋白）可以水解YTM的环丙基，从而起到YTM失活的目的。接下来他们揭示了GyrI-like家族的一个亚家族蛋白（截至2016年9月已有1696条蛋白序列都来源于原核生物）具有水解YTM和CC-1065环丙基的特性，这也是GyrI-like家族蛋白成员首次证明具有酶的活性（作者将这类酶定义为cyclopropanoid cyclopropyl hydrolase, CCH）。

图1. CCH蛋白催化环丙烷化合物的环丙基水解反应

为了深入阐明CCH是如何识别并催化底物中环丙基水解反应的机理，唐功利课题组与上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室的周佳海（点击查看介绍）课题组以及瑞士洛桑联邦理工学院EPFL的袁曙光（点击查看介绍）课题组在晶体学和计算生物学方面展开合作，通过共晶结构以及分子动力学模拟发现，CCH蛋白都具有一个保守的用于多种底物结合的芳香口袋（由Y46、W85、W99、F154和Y187组成）以及两个高度保守的负责催化的酸性氨基酸残基对（E185/E157）。作者通过点突变实验证实了这个芳香口袋和催化残基在YTM和CC-1065环丙基水解反应中起着关键作用，随后提出了可能的催化机理。

图2. 通过共晶复合物以及分子动力学模拟研究CCH蛋白成员lin2189与底物YTM的识别

接下来，作者从CCH蛋白中选取四个代表成员YtkR7、lin2189（来源于Listeria innocua）、ETI84332.1（来源于Streptococcus anginosus，属于肠道微生物）以及MA1133（来源于Methanosarcina acetivorans），并将其分别转化大肠杆菌，发现这些蛋白都能够赋予大肠杆菌对YTM的抗性。

GyrI-like蛋白广泛存在于原核与真核生物中（截至2016年9月已有12304条蛋白序列），这类蛋白被注释为小分子结合蛋白。但是这种小分子结合属性仅限于对枯草芽孢杆菌MerR家族调控蛋白BmrR的研究。BmrR可以对多种结构不同的配体化合物进行响应，而结合了配体的BmrR能够激活多药抗性外排泵蛋白Bmr基因的转录，从而起到细胞的自我保护作用。SbmC和Rob是GyrI-like家族蛋白中另外两个已报道的具有生理功能的成员。但是，SbmC和Rob是否能结合小分子尚无文献报道。因此，在文章最后，作者通过分子互作分析（SPR）证明了SbmC、Rob以及YtkR7均保留了结合若干抗生素的能力。

CCH蛋白功能的发现使人们重新审视GyrI-like蛋白功能，即生物体利用GyrI-like蛋白作为抗生素抗性蛋白可能是一种古老的现象，这类蛋白可以看作是细胞内的清道夫，通过隔离外源性有毒化合物达到保护细胞的目的。因此，这项工作不仅为真核生物中GyrI-like蛋白的功能研究提供了重要的借鉴，也为药物研发领域提供了一定的参考意义。

这一成果发表在最近的Nature Communications 上，唐功利课题组的袁华副研究员和周佳海课题组的张金儒博士为共同第一作者。该工作得到国家自然科学基金委、上海市科委和中国科学院战略性先导科技专项（B类）等经费的大力资助。

该论文作者为：Hua Yuan, Jinru Zhang, Yujuan Cai, Sheng Wu, Kui Yang, H. C. Stephen Chan, Wei Huang, Wen-Bing Jin, Yan Li, Yue Yin, Yasuhiro Igarashi, Shuguang Yuan, Jiahai Zhou & Gong-Li Tang

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

GyrI-like proteins catalyze cyclopropanoid hydrolysis to confer cellular protection

Nat. Commun., 2017, DOI: 10.1038/s41467-017-01508-1

导师介绍

唐功利

http://www.x-mol.com/university/faculty/15570

周佳海

http://www.x-mol.com/university/faculty/15579

袁曙光

http://www.x-mol.com/university/faculty/45898

课题组链接

http://www.gpcrm.org