南开大学：酶催化反应不稳定中间体的三维完整真实结构揭示金属离子结合与底物识别的正协同作用

原子分辨率的三维结构对于理解蛋白质的结构、动力学以及功能至关重要。其中，蛋白酶与底物分子共价连接的催化反应中间体结构对于底物识别机制以及催化反应机理的理解尤为重要。然而，酶催化反应是非平衡态体系，真实的酶催化反应中间体在溶液中含量低、存在时间短，难以通过常规生物物理技术获得其高分辨的溶液三维结构。通常情况下，人们基本利用稳定类似物获得中间体结构并基于获得的结构阐述蛋白质的动态与功能的关系。但是，稳定中间体的类似物往往与真实中间体复合物存在几个或多个化学键或原子特性的差异，这些差异通常情况下可能会被忽略甚至导致完全相反的细微结构，因此难以呈现催化反应中间体的真实结构，从而可能掩盖底物识别及催化反应机理的关键信息。因此，发展高效的生物物理方法以此获得不稳定、低含量真实中间体的真实结构具有重要意义。

鉴于此，南开大学元素有机化学国家重点实验室苏循成教授（点击查看介绍）团队以金黄色葡萄球菌分类酶sortase A（SrtA）为例，发展了结合位点特异性顺磁标记技术和选择性同位素标记方法解析短寿命酶催化中间体复合物三维结构的策略。顺磁镧系离子在核磁共振谱图中产生的顺磁效应-赝接触位移（PCS），PCS测定准确快速并且包含丰富的距离和角度信息，在生物大分子互作研究中是一类灵敏的结构约束条件。分类酶SrtA能够特异性识别含有LPXTG（X为任意氨基酸）序列的底物蛋白并切断Thr与Gly之间的酰胺键，SrtA活性位点C184的活性巯基与LPXTG中Thr的羰基形成硫酯中间体，随后水分子或者第二个亲核底物多聚甘氨酸进攻硫酯键发生水解反应或者转肽反应（图1）。在前期研究中，该团队仅仅获得了不稳定硫酯中间体中蛋白质的三维结构，对于底物与酶的互作及相互关系，仍然缺乏深入的了解（Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 13744-13748）。在该工作中，作者首先利用课题组发展的位点特异性顺磁标记技术将两种不同的顺磁探针分别共价修饰在SrtA的结构表面（图2）。由于SrtA能够结合一个Ca²⁺，并且该课题组的前期研究中发现Ca²⁺是该催化反应进行的关键因素 (Sci. Rep. 2018, 8, 16371)。因此，作者选用的顺磁探针同时能满足两个关键条件，一是对蛋白质表面的Cys具有较高的反应选择性，不干扰催化位点活性；二是探针对顺磁镧系离子具有高亲合力，确保镧系离子和探针结合与SrtA-Ca²⁺结合之间互不干扰（图2）。

图1. 分类酶SrtA与底物LPETG的催化反应循环示意图。图片来源：ACS Catal.

图2. SrtA的位点特异性顺磁标记反应示意图。图片来源：ACS Catal.

随后作者利用定点顺磁标记的天然丰度的SrtA与同位素（¹³C和¹⁵N）标记的融合LPXTG的蛋白底物混合，在Ca²⁺存在下，通过快速测定反应混合物的核磁共振谱图，测定得到硫酯中间体复合物中LPXTG底物的核磁共振信号及其相应的PCS。结合选择性同位素标记氨基酸方法，作者确定了硫酯中间体中底物LPXTG的主链和侧链共振信号归属以及相应的PCS值（图3）。根据测定得到的硫酯中间体中SrtA以及底物LPXTG的PCS数据，作者测定了溶液中硫酯中间体复合物完整的三维结构。

图3. SrtA与底物LPETG形成的瞬态硫酯中间体复合物中底物部分的顺磁效应PCS测定。图片来源：ACS Catal.

作者计算得到的硫酯中间体复合物中底物LPXT中Thr的侧链朝向底物结合口袋，并与结合口袋的残基形成疏水和氢键相互作用；LPXT中的X侧链朝向溶剂，与SrtA表面没有明显的相互作用；此外，硫酯中间体中硫酯键朝向催化位点的H120侧链，为下一步的水解或者转肽反应做好准备（图4）。硫酯中间体中LPXT底物的构象很好地解释了LPXT中氨基酸的保守性以及催化反应的机理，这是二硫键连接的硫酯中间体类似物难以获得的重要信息。该方法测定的真实反应硫酯中间体的三维结构与文献报道的硫酯中间体类似物（J. Biol. Chem. 2009, 284, 24465-24477）具有显著的差异，特别是保守氨基酸Thr和非保守氨基酸X具有相反的取向（图4）。

图4. 利用顺磁效应PCS计算得到的溶液中SrtA硫酯中间体复合物（A）与文献报道的二硫键中间体类似物（B）中底物构象对比。图片来源：ACS Catal.

在解析的硫酯中间体复合物结构中，催化反应必需的Ca²⁺与底物LPXTG并没有直接的相互作用（Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 13744-13748），然而该课题组前期的研究中发现硫酯中间体对Ca²⁺的结合力比游离SrtA强约30倍（Sci. Rep. 2018, 8, 16371）。为了探究Ca²⁺结合与底物LPXTG识别的协同机制，该团队制备了L169A、E171A突变体以及相应的二硫键中间体类似物并测定了与Ca²⁺的结合能力（表1）。L169对于底物LPXTG的识别至关重要，L169A突变体对Ca²⁺的结合降低了约15倍，而L169A二硫键中间体类似物对Ca²⁺的结合没有明显的提高。正如预期，E171参与Ca²⁺的配位，E171A突变体对Ca²⁺的结合显著降低（约22倍），然而E171A二硫键类似物对Ca²⁺的结合提高了约20倍，与WT SrtA类似。这些结果进一步表明SrtA与底物LPXTG的识别与Ca²⁺结合具有显著的协同作用，解析的硫酯中间体复合物结构也很好地解释了这种协同作用。

表1. SrtA、突变体及其相应的硫酯中间体类似物与Ca²⁺结合的解离常数K_D （μM）（表格来源：ACS Catal. 2023, 13, 11610−11624）

此外，作者利用MALDI-TOF质谱方法测定了硫酯中间体在不同情况下的水解速率，作者发现在没有Ca²⁺存在下硫酯中间体的水解速率加快了约30倍。根据阿伦尼乌斯公式，Ca²⁺存在对硫酯中间体水解速率的影响相当于硫酯中间体水解的活化能增加了约1.9 kcal/mol（图5）。这表明Ca²⁺不仅通过调节SrtA的构象促进了硫酯中间体的生成，同时也增加了硫酯中间体水解的活化能，从而增加硫酯中间体的寿命，为下一步的转肽反应提供了充分的立体空间。

图5. Ca²⁺结合提高了硫酯中间体复合物的稳定性。图片来源：ACS Catal.

小结

南开大学苏循成课题组综合运用了蛋白质定点标记策略、顺磁核磁共振技术和选择性蛋白质同位素标记策略，以高效的PCS为结构约束，建立了一类在真实反应体系中不稳定（半衰期< 3 h）、低含量（< 40 μM）的蛋白质酶与底物形成的催化中间体的三维结构的生物物理方法。通过该方法，该团队测定了溶液中分类酶SrtA在酶催化反应过程中不稳定的瞬时硫酯中间体复合物结构，系统阐述SrtA与底物之间识别特异性互作方式以及Ca²⁺在底物识别和催化过程中的协同作用机制。该方法有望应用于多种蛋白酶不稳定中间体的三维结构解析，从高分辨的角度深入了解这类不稳定蛋白质机器的底物识别机制与功能的关系，并为相关的药物设计提供重要的结构和动态信息。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

3D Structure of the Transient Intermediate of the Enzyme–Substrate Complex of Sortase A Reveals How Calcium Binding and Substrate Recognition Cooperate in Substrate Activation

Jia-Liang Chen, Xiao Wang, Feng Yang, Bin Li, Gottfried Otting, and Xun-Cheng Su*

ACS Catal., 2023, 13, 11610–11624, DOI: 10.1021/acscatal.3c02214

导师介绍

苏循成：教授，博导，南开大学元素有机化学国家重点实验室。在蛋白质修饰的化学选择性、顺磁探针的质量和顺磁效应的定量评价与分析方面做了大量工作，发展了一系列较为广泛的蛋白质定点标记方法和应用于细胞内磁共振研究的顺磁探针。最近研究主要集中于活细胞的蛋白质定点标记方法及应用与手性化合物测定方法学研究。在Acc. Chem. Res., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Angew. Chem. Int. Ed., J. Am. Chem. Soc, ACS Cent. Sci., ACS Catal., Anal. Chem.等期刊已发表论文 100余篇，主持国家自然科学基金面上项目、国际交流合作项目、参与国家重点研发计划等基金10余项。 

课题组网站：

http://skleoc.nankai.edu.cn/info/1018/4552.htm 

https://www.x-mol.com/university/faculty/11898 

第一作者

陈家良：南开大学博士后（苏循成课题组），现工作于枣庄学院化工学院。主要从事顺磁探针的刚性评价分析以及顺磁核磁共振在蛋白质动态结构-功能关系的研究，最近研究集中于顺磁核磁共振在手性分子识别中的应用。在Angew. Chem. Int. Ed., ACS Catal., Chem. Commun., J. Phys. Chem. Lett., Chem. Eur. J., ChemBioChem, Phys. Chem. Chem. Phys.和 J. Biomol. NMR等期刊发表论文20余篇，入选国家博士后创新人才支持计划项目(2017)，目前主持国家自然科学基金青年项目、面上项目、山东省高校青年创新团队支持计划项目各1项。