广西师范大学赵书林教授课题组近年来工作进展

赵书林教授简介

赵书林，广西师范大学二级教授，博士生导师，药用资源化学与药物分子工程省部共建国家重点实验室学术带头人，中国化学会有机分析专业委员会委员，中国纳米学会微纳流控技术分会理事，广西壮族自治区八桂学者、优秀专家，八桂名师，国务院政府特殊津贴专家。在湖南大学获学士和硕士学位，四川大学获博士学位，美国杰克逊州立大学访问学者（1999-2001年），俄罗斯莫斯科大学化学系合作研究（2013-2015；2021-2022年）。2003-2011年任广西师范大学化学化工学院副院长。2012-2016年任广西师范大学化学与药学学院院长。2016至今任广西师范大学化学与药学学院学术委员会主任。曾任广西化学化工学会副理事长，分析测试专业委员会主任。

赵书林教授的主要研究领域为：生物成像新技术，诊疗一体化及单细胞分析新方法。已主持各类科研课题30多项，其中国家自然科学基金项目11项。在Science Advances、Chemical Science、Analytical Chemistry、Advanced Healthcare Materials、《中国科学-化学》等国内外学术期刊上发表学术论文500余篇，获国家授权发明专利15项。参写中英文专著5部，制定国家标准2项。获省部级科学技术奖9项，其中广西自然科学奖一等奖4项。

本文选取赵书林教授课题组近三年来在光声成像和单细胞分析和诊疗一体化领域的主要相关文章来介绍赵书林教授的近期研究工作。

（一）光声成像新技术

光声成像是一种基于光激发和超声检测相结合的生物医学成像新技术。由于声波在生物组织中的衰减比光波低2到3个数量级，生物组织的光声成像提供了良好的对比度、超空间分辨率、高穿透性和高灵敏度。光声成像可以避免生物组织中的强光散射，提供一个能够穿透7 cm的光声信号，空间分辨率可达100 μm，超过了传统光学成像的光学扩散阈值和穿透深度。因此，光声成像是一种很有前途的体内深层组织的生物成像技术，在生物医学研究和疾病分子诊断方面具有巨大的应用潜力。

（1）提出了一种由肿瘤微环境激活的原位动态观测肿瘤生长的光声成像和光热治疗的新方法

赵书林教授课题组于2021年发表在Science Advances（Sci. Adv., 2021, 7, eabe3588）的工作报道了一种肿瘤微环境诱导吸收光谱红移的铁、铜共掺杂聚苯胺纳米粒子（Fe-Cu@PANI）。他们发现该纳米粒子中的Cu(II) 可在肿瘤组织中与内源性GSH发生氧化还原反应，氧化还原反应导致了纳米粒子的蚀刻，并随着GSH浓度的增加纳米粒子的粒径逐渐减小，诱导该纳米粒子的吸收光谱从可见光区域红移至近红外光区域，同时激活肿瘤的光声成像和光热治疗（PTT），从而提高了体内肿瘤成像的精准度和光热治疗的靶向性。该项研究制备的纳米粒子在癌症的精准诊断和靶向治疗中具有广阔的应用前景。

图1. Fe-Cu@PANI纳米粒子的制备及肿瘤光声成像和PTT激活机制示意图

基于该研究提出的光声成像原理，他们以Fe-Cu@PANI纳米粒子作为光声探针利用光声成像跟踪了肿瘤发育过程中的生长。在小鼠后腿根部注射4T1细胞后，分别在4、6、8、10、12和14天监测了肿瘤的生长过程。监测结果显示，肿瘤组织的光声信号随着肿瘤生长时间的增加而逐渐增强。在最初的6天里，光声信号相对较低，但从第6天到第12天，随时间的延长光声信号增强很明显，并且在12天后光声信号强度趋于稳定（图2）。这些结果表明，在荷瘤小鼠肿瘤组织中，GSH水平与肿瘤生长的速率有关，制备的Fe-Cu@PANI纳米粒子可作为一种肿瘤微环境激活的光声探针来监测肿瘤的增长速率。

图2. 荷瘤小鼠体内肿瘤微环境激活的光声成像。在荷瘤小鼠体内肿瘤生长的不同时期 (天)，在小鼠的肿瘤部位注射Fe-Cu@PANI纳米粒子后获得的光声成像图 (上图) 和对应的光声信号强度（下图）。

他们还利用4T1荷瘤小鼠模型评价了Fe-Cu@PANI纳米粒子作为光热治疗剂进行肿瘤PTT的效果（图3）。结果表明，Fe-Cu@PANI纳米粒子和激光照射相结合，对肿瘤生长有显著的抑制作用。在治疗4天后，肿瘤组织几乎完全消失，并且在随后的12天内肿瘤没有复发。

图3. Fe-Cu@PANI纳米粒子用于荷瘤小鼠体内肿瘤的PTT。(A) 用808-nm激光照射注入了Fe-Cu@PANI纳米粒子或PBS的肿瘤部位的热成像图；(B) 接受不同治疗的四组荷瘤小鼠在0、8、16天的照片；(C) 接受不同治疗荷瘤小鼠肿瘤组织的温度变化。(D) 荷瘤小鼠肿瘤体积随治疗时间（天）的变化；(E) 荷瘤小鼠体重随治疗时间（天）的变化；(F) 治疗16天后解剖出的荷瘤小鼠肿瘤组织照片； (G) 接受不同治疗的荷瘤小鼠在治疗16天后解剖出小鼠的心、肝、脾、肺和肾脏组织的H&E染色。

（2）合成了国际上第一个硒醇激活的比率光声成像探针用于对自身免疫性肝炎进行可视化监测

自身免疫性肝炎（AIH）是继病毒性肝炎后第二大肝脏炎症疾病。然而，AIH的发病机制尚不清楚，更缺乏准确有效的诊断方法。硒醇是重要的抗氧化分子，能有效清除炎症过程中产生的大量活性氧。为了在体内探讨硒醇在上述过程中的作用机制，赵书林教授课题组设计合成了国际上第一个硒醇光声探针（APSel）。并将其用于对AIH的病理进展进行可视化监测。该工作2021年发表在Chemical Science（Chem. Sci., 2021, 12, 4883–4888）上。

图4. 硒醇的光声检测原理。(a) 探针（APSel）与硒醇的反应示意图。(b) 比率光声成像原理。APSel与硒醇反应前后的 (c) 光声光谱。

开发的光声探针APSel与硒醇反应后会导致其光声光谱峰从860 nm蓝移到690 nm，进而可以实现光声比率成像，并且该APSel探针对硒醇具有很高的灵敏度和选择性。

图5. 探针对硒醇的特异性反应。(a) PASel溶液在690和860 nm处的光声成像。两个波长的 (b) 光声信号强度比与硒醇浓度呈线性关系。(c) APSel与不同浓度硒醇反应后的吸收光谱；插图为反应前后的溶液颜色。

通过在小鼠后背皮下注射探针和外源性硒醇，证实了探针在活体内拥有检测硒醇的能力。随后，分别在正常和AIH模型小鼠中尾静脉注射APSel，解剖肝脏进行离体光声成像。实验结果表明，AIH模型组小鼠的肝脏中硒醇含量比正常小鼠下降。本工作合成的硒醇比率光声探针（APSel）为研究AIH疾病的发病机制提供了一种新工具。

图6. 通过硒醇的比率光声成像监测AIH的病理进展。(a) 使用光声探针监测AIH病理进展的示意图。(b) 不同条件下肝脏组织的体外光声成像。(c) 不同条件下小鼠肝脏ΔPA₆₉₀/ΔPA₈₆₀值的变化。

（3）合成了国际上第一个脑内荧光-光声双模式成像探针用于抑郁症的可视化精确诊断和药物干预示踪

阐明抑郁症的病理生理学是一项独特的挑战。抑郁症与去甲肾上腺素（NE）水平降低密切相关。因此，开发生物成像探针以可视化大脑中的NE水平是阐明抑郁症病理生理过程的关键。然而，由于NE在结构和化学性质上与其它两种儿茶酚胺神经递质肾上腺素和多巴胺相似，因此设计NE特异性多模式生物成像探针是一项艰巨的任务。为此，赵书林教授课题组设计合成了国际上第一个用于NE的近红外荧光-光声双模态成像探针（FPNE）。NE的β-羟乙胺显示通过亲核取代和分子内亲核环化反应，导致探针分子中的碳酸酯键断裂并释放部花青分子（IR-720）。该过程使反应液颜色由蓝紫色变为绿色，吸收峰由585 nm红移至720 nm。在720 nm光激发下，观察到NE浓度与PA响应和荧光信号强度之间的线性关系。因此，在通过尾静脉注射FPNE后，通过大脑区域的荧光和PA成像，在小鼠模型中实现了使用脑内原位可视化诊断抑郁症和监测药物的干预。 该工作2023年以封面文章的形式发表在Analytical Chemistry （Anal. Chem., 2023, 95, 5384−5392）上。

图7. 探针对去甲肾上腺素的反应机制以及去甲肾上腺素水平的脑内可视化原理

该探针（FPNE）与NE响应的光学特性和选择性如下图所示：

图8. (a) FPNE与NE反应前后的吸收光谱。(b) 不同浓度NE存在下溶液的荧光光谱。(c) 在NE浓度增加时，溶液的荧光强度。(d) FPNE与NE反应后720 nm处的PA强度与NE浓度的线性图。 (e) 探针与不同物质反应时，720 nm处的PA强度。 (f) 不同物质的混合物溶液和FPNE在37°C孵育5 min后的荧光光谱。

考虑到抑郁小鼠大脑中NE水平的降低，他们研究了使用已开发的探针用于抑郁症的脑原位视觉诊断的可行性。使用皮质酮法建立小鼠抑郁症模型，使用多波长断层扫描（MSOT）模式来确定尾静脉注射后探针到达脑区所需的时间。结果显示，在尾静脉注射探针后约20 min时，脑区PA信号强度达到最大值，在40 min后PA信号几乎消失。这一时间过程表明，注射到尾静脉的探针溶液到达了脑区的时间约为20 min，并与脑内的NE发生反应。根据阳性生物安全性和动力学结果，将实验小鼠分为4组，包括健康小鼠对照组和3组抑郁模型组。在对照组小鼠和一组模型小鼠腹腔内分别注射生理盐水。另外两组模型小鼠腹腔注射10或20 mg/kg的抗抑郁药氟西汀。氟西汀给药40 min后，经尾静脉注射FPNE（0.22 mg/kg），小鼠脑区MSOT和荧光成像20 min后进行实验（图8a）。根据图8d所示的MSOT结果，可以参考上矢状窦来清晰地定位大脑区域，因为图像中的这个结构与冷冻图像中的位置相匹配剖图（图8b)。在四组小鼠中，对照组小鼠的大脑中MSOT信号最强，而在用生理盐水处理的模型小鼠的大脑中MSOT信号最弱。这些结果与抑郁症模型小鼠大脑中NE含量的减少相一致。用氟西汀治疗的模型小鼠的大脑中MSOT信号增强，提示这种药物治疗在一定程度上恢复了NE水平。

图9. (a) 使用双模成像探针监测抑郁症病理进展的程序示意图。(b) 雄性小鼠的大脑横截面的冷冻切片图像。(c) 尾静脉注射生理盐水或FPNE后不同时间点小鼠脑区横截面的光声成像。(d) 四组小鼠脑区的光声成像图。(e) 四组小鼠脑区的荧光成像图。(f) 对应于d和e图中光声和荧光强度的量化图。

（二）单细胞分析新方法

细胞异质性是所有生物体中普遍存在的现象。关于细胞异质性的信息主要通过单细胞分析获得，这有助于进一步了解生命活动的性质和内部机制。细胞中的蛋白质组学差异是细胞异质性的重要表现，并为进一步的研究提供了方向。蛋白质是细胞生长、分裂、信号转导和催化生化过程的重要组成部分。此外，单个细胞中MicroRNA (miRNA) 的定量可以帮助科学家从在单细胞水平上理解不同miRNA和不同类型癌症之间的关系。然而，目前在开发用于单个细胞中微量miRNAs和蛋白质的绝对定量技术方面仍然存在挑战。近年来，赵书林教授课题组提出了一系列细胞内信号扩增策略，实现了单个细胞中微量miRNAs和蛋白质的绝对定量。

（1）提出了一种细胞内化学发光信号滚环扩增策略用于单细胞中miRNA的绝对定量

单个细胞中的绝对定量可以更好地理解细胞的异质性以及细胞与疾病之间的关系。然而，由于单个细胞中miRNA的含量很低，因此对单个细胞中miRNA定量方法的报道很少。为此，赵书林教授课题组提出了一种基于微芯片平台上滚动圆扩增（RCA）的超灵敏化学发光分析策略，用于单细胞内miRNA的绝对定量。该策略设计并合成了一种特异性DNA环状探针，可以对目标miRNA进行RCA，提高测定的灵敏度，以满足单细胞内miRNA绝对定量的需要。该工作2021年以封面文章的形式发表在Analytical Chemistry（Anal. Chem., 2021, 93, 9218−9225）上。

图10. 当期Analytical Chemistry 杂志的封面及方法原理示意图

该方法选择miRNA-21作为miRNA的模型分析物，以miRNA-21浓度的lgC(M) 值为横坐标，化学发光信号峰的峰面积Y(mVs) 为纵坐标，进行线性回归，得到工作曲线，其检测miRNA-21的线性范 围为4.0×10^-14至1.0×10^-9 mol/L，检测极限为1.0×10^-14 mol/L。

利用发展的方法，分别对20个正常肝细胞（HL-7702）和20个肝癌细胞（HepG2）进行了分析，分析结果如下图所示。结果发现在20个HL-7702和20个HepG2细胞中miRNA-21的含量没有任何一个细胞是相同，证明细胞存在异质性。HL-7702和HepG2细胞中miRNA-21的平均含量分别为1800拷贝数/细胞，和7600拷贝数/细胞。HepG2细胞中miRNA-21的含量远高于HL-7702细胞，表明癌细胞中miRNA-21过表达，这与miRNA-21在大多数癌症疾病中过表达的事实相一致。进一步证明了miRNA-21是一种具有应用潜力的肿瘤标记物。

图11. 20个正常肝细胞 （HL-7702）和20个肝癌细胞（HepG2）中的miRNA-21的定量分析结果（拷贝数/细胞）

（2）提出了一种细胞内多组分同步DNA行走放大策略，实现了单个细胞中两种肿瘤相关微量蛋白的同时定量

赵书林教授课题组设计了一种多元DNA步行荧光纳米探针，用于同时定量两种癌症相关蛋白：核仁蛋白（NCL）和胸腺苷激酶1（TK1）。NCL和TK1的测定有助于监测实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤的发生和发展情况。使用设计的纳米探针对NCL和TK1进行细胞内同时信号放大，并在微芯片电泳平台上，采用激光诱导荧光（MCE-LIF）法分别检测20个HepG2细胞和20个HL-7702细胞中NCL和TK1的含量。该方法具有高灵敏度和特异性，可用于单细胞中NCL和TK1的同时绝对定量分析。此外，利用合理的DNA序列设计，可以在单个细胞中完成对其它蛋白质或多个蛋白质的绝对定量。该工作2022年以封面文章的形式发表在Analytical Chemistry（Anal. Chem., 2022, 94, 15847−15855）上。

图12. 当期Analytical Chemistry 杂志的封面及方法原理示意图

他们使用该策略，分析了20个HL-7702细胞和20个HepG2细胞。图12中A和B是三个HL-7702细胞和三个HepG2细胞的典型电泳图。电泳曲线显示：同一个细胞中NCL和TK1能完全分离，在同一类型细胞中NCL和TK1的峰面积不同。在不同类型细胞中NCL和TK1的峰面积相差较大，说明了细胞中蛋白质组的异质性。20 个HepG2细胞和20 个HL-7702细胞中NCL和TK1含量的绝对定量结果如下图C、D、E和F所示。HepG2细胞中NCL和TK1的平均含量分别为43.7±3.5 zmol/cell 和55.1±5.6 zmol/cell，而HL-7702细胞中NCL和TK1的平均含量分别为4.98±0.68 zmol/cell 和9.44±1.36 zmol/cell。HepG2细胞中NCL和TK1的平均水平约为HL-7702的8.7倍和5.8倍，表明HepG2细胞中NCL和TK1的水平显著高于HL-7702。这些测定结果证明NCL和TK1是重要的肿瘤标志物，在肝癌中过表达。在同一类型细胞中，细胞之间NCL和TK1的含量也有较大差异。因此，通过对单个细胞中的NCL和TK1的分析，可以进一步了解细胞中蛋白组的差异，这对研究蛋白质与肝癌之间的关系具有重要意义。此外，在单个细胞中同时定量多个蛋白，对于深入了解细胞蛋白的生物学作用提供了见解。

图13. (A) 3个HepG2细胞的典型电泳图。峰识别：1. NCL, 2.TK1. (B) 3个HL-7702细胞的典型电泳图。峰识别：1. NCL, 2. TK1. (C) 20个HepG2细胞中NCL的含量 (zmol/cell)。(D) 20个HL-7702细胞中NCL的含量 (zmol/cell)。(E) 20个HepG2细胞中TK1的含量 (zmol/cell)。(F) 20个HL-7702细胞中TK1的含量 (zmol/cell)。

（3）提出了一种框架核酸介导的多模式串联多变量信号扩增策略，实现了在单个细胞中三种不同miRNAs的同时绝对定量

同时定量单个细胞中的多个miRNAs可以帮助科学家从miRNA组学的角度在单细胞水平上理解不同miRNA组和不同类型癌症之间的关系。然而，目前在开发用于同时绝对定量单个细胞中多种miRNAs的技术方面仍然存在挑战。赵书林教授课题组提出了一个框架核酸（FNA）介导的多模式串联多变量信号扩增策略，用于同时绝对定量单个细胞中三种不同的miRNAs。在该研究中，首先制备了DNA六面体FNAs (DHFs) 和DNA四面体FNAs (DTFs)，然后将多个DNA发夹和底物连接到六面体框架核酸上作为靶识别单元，并将四面体框架核酸上带有标记的FAM荧光团的三个底物作为信号输出单元。在这两种类型的FNA进入细胞后，它们与三种不同的miRNA (miRNA-155、miRNA-373和miRNA-21) 反应，多模式串联多变量信号扩增同时启动，将三种miRNA的检测限分别降低到8×10^–15、2×10^–15和1×10^–15 mol/L。三种miRNAs的检测灵敏度同时提高了六个数量级，达到了单细胞中微量miRNAs的定量要求。在微芯片电泳平台上结合单细胞注射、膜融化和细胞内成分分离技术，实现了对单细胞中三种不同miRNAs的同时绝对定量，从而提供了一种可用于单细胞中miRNA组学研究的重要方法。该工作2023年发表在Analytical Chemistry（Anal. Chem., 2023, 95, 11061−11069）上。

图14. 方法原理示意图

他们使用该策略，从五个不同细胞系中分别获得了20个随机的单个细胞中miRNA-155、miRNA-373和miRNA-21同时定量结果。定量结果如图14所示：(1) 从五种不同类型细胞中随机选取的20个细胞中，miRNA-155、miRNA-373、miRNA-21的含量均呈正态分布；(2) 癌细胞（Hela、MCF-7、HepG2）中miRNA-155、miRNA-373、miRNA-21的含量均高于正常细胞（MCF-10A、HL-7702）；(3) MCF-7细胞中miRNA-155、miRNA-373、miRNA-21的含量均高于Hela、HepG2细胞；(4) MCF-7细胞中miRNA-155、miRNA-373含量最高，miRNA-21含量第二高，miRNA-155含量最低。而在Hela、HepG2、MCF-10A和HL-7702细胞中，miRNA-21的含量最高，其次是miRNA-373，而miRNA-155的含量最低。

图15. 从五个不同细胞系中分别获得的20个随机单细胞中miRNA-155、miRNA-373和miRNA-21的含量（拷贝数/细胞）的分布图。（A）Hela细胞；（B）MCF-7细胞；（C）MCF-10A细胞；（D）HepG2细胞；（E）HL-7702细胞。

（三）诊疗一体化新技术

生物成像引导下的治疗将诊断和治疗能力整合到单一的实体中，具有在早期疾病检测、评估治疗药物在病灶部位的积累并预测治疗效果的能力，这种诊疗一体化策略为精准医疗提供了机会。然而，由于大多数现有的诊疗一体化系统只是通过纳米封装或生物偶联将治疗药物与成像探针结合起来，这种治疗探针的疗效强烈依赖于疾病组织和正常组织之间探针浓度的差异，这不可避免地导致信号干扰，并在正常组织中产生副作用。理想的癌症诊疗一体化探针应该只有在肿瘤微环境中检测到靶向生物标志物时才会同时启动成像和药理作用。因此，开发肿瘤微环境激活的纳米诊断和治疗一体化平台，提高诊断和治疗性能，同时减少对生物系统和器官的毒副作用，对精确的癌症医学具有高度的吸引力。近年来，各种激活性纳米平台受到了极大的关注。与传统的无响应性纳米平台相比，可激活的纳米平台不仅可以在所需的时间和位置精确地进行治疗，而且还可以减少对正常组织的副作用。因此，开发具有良好生物相容性的肿瘤微环境激活的诊疗一体化纳米平台，对于实现癌症的精准医疗具有极其重要的意义。

（1）提出了纳米酶触发肿瘤微环境激活的NIR-II光声成像和化学动力学/光热联合治疗新技术

纳米酶是一种能够模拟天然酶活性的纳米材料，其特点是合成工艺简单、成本低、催化活性可调、在恶劣环境下稳定性高。纳米酶在生物传感、生物成像、疾病的诊断和治疗等领域已得广泛应用。然而，目前还没有关于纳米酶激活肿瘤组织的光声成像的报道。为了实现肿瘤微环境激活的NIR-II光声成像（PAI）和化学动力学/光热联合治疗，提高肿瘤诊断的准确性和肿瘤的治疗效率，赵书林教授课题组设计制备了一种具有氧空位的多功能纳米酶（Ox-POM@Cu）。该纳米酶同时具有谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶等性质，能在肿瘤微环境下与GSH发生氧化还原反应，并催化该反应，从而消耗GSH。而Ox-POM@Cu中的部分Mo⁶⁺被还原为Mo⁵⁺,在肿瘤的弱酸性环境中形成Mo⁶⁺/Mo⁵⁺ POM。POM在NIR-II区域表现出很强的吸收，这使它能够激活肿瘤组织的NIR-II PAI和光热治疗（PTT）。随后，纳米酶中的Cu²⁺与肿瘤微环境中的过氧化氢（H₂O₂）发生类芬顿反应，并且纳米酶中的Cu⁺能催化该反应，快速产生•OH。由于GSH的消耗可以维持产生的•OH的浓度，从而实现了对肿瘤的化学动力学治疗（CDT）。该研究不仅为肿瘤微环境诱导的NIR-II PAI的设计提供了新的策略， 而且为增强癌症治疗提供了新的见解。该工作2022年以封面文章的形式发表在Advanced Healthcare Materials（Adv. Healthcare Mater., 2022, 11, 2102073）上。

图16. 当期Advanced Healthcare Materials 杂志的封面及方法原理示意图

Ox-POM@Cu纳米酶在肿瘤微环境中的NIR-II 光声成像结果如图16所示。

图17. (a) 原位注射Ox-POM@Cu后0.5、1、2、6、12 h，荷瘤小鼠的PAI。T表示肿瘤组织，N表示正常组织。(b) 尾静脉注射Ox-POM@Cu后1、2、4、8、12 h，荷瘤小鼠肿瘤组织的PA图像。(c) 对应于 (a) 的荷瘤小鼠肿瘤组织和正常组织PA信号强度。(d) 对应于 (b) 的荷瘤小鼠肿瘤组织PA信号强度。

Ox-POM@Cu纳米酶用于体内化学动力学和光热的联合肿瘤治疗效果如图17所示。

图18. (a) 不同治疗组在治疗0、8、16天后，荷瘤小鼠及其肿瘤区域的照片。(b) 不同治疗组，荷瘤小鼠的肿瘤组织体积与治疗时间的关系曲线。(c) 不同治疗组治疗荷瘤小鼠16天后，解剖的肿瘤组织照片。(d) 不同治疗组在治疗期间荷瘤小鼠的体重与治疗时间的关系曲线。(e) 不同处理后的荷瘤小鼠不同器官切片的H&E染色。

（2）开发了一种H₂O₂自供和谷胱甘肽耗竭工程纳米组件，用于肿瘤微环境激活的NIR-II光声成像和光热增强、气体/饥饿启动的化学动力学治疗

该纳米组件由氧空位二氧化钛（TiO_2-x）表面构造铜、硫掺杂的介孔二氧化硅（Cu,S-MONs）和葡萄糖氧化酶（GOx）组成（TiO_2-x@Cu,S-MONs@GOx，TMG）。肿瘤微环境中高表达谷胱甘肽（GSH）能够还原TMG纳米组件中的四硫键和Cu²⁺生成硫离子和Cu⁺，导致四硫键断裂纳米组件的介孔结构崩溃，从而释放游离的Cu⁺和TiO_2-x纳米粒子，并产生硫化氢（H₂S）气体。在1064 nm激光照射下，TiO_2-x纳米粒子同时产生光声信号和光热效应，实现肿瘤的NIR-II PA成像和光热治疗。释放的Cu⁺ 与肿瘤组织中的H₂O₂发生类Fenton反应产生羟基自由基（∙OH），实现肿瘤的CDT。纳米组件表面的GOx催化癌细胞内葡萄糖的氧化还原反应生成葡萄糖酸和H₂O₂，导致葡萄糖耗竭，实现肿瘤的饥饿治疗。H₂S的产生导致线粒体损伤，能够协同增强抗肿瘤疗效。另一方面，TiO_2-x纳米粒子中的氧空位增强了肿瘤的光热疗效，级联反应产生的H₂O₂和GSH的耗竭又提高了Fenton反应的效率，增强了CDT的疗效（见下图）。因此，TMG纳米组件可作为一种优秀的肿瘤诊疗剂，在成像指导的癌症精准诊断和靶向高效治疗中发挥重要作用。该工作2023年发表在ACS Applied Materials Interfaces（ACS Appl. Mater. Interfaces, 2023, 15, 38309−38322）。

图19. 方法原理示意图

由于TMG纳米颗粒具有良好的体外PA成像性能和生物相容性，因此利用PA成像检测肿瘤部位TMG纳米颗粒的积累可以指导肿瘤治疗。以4T1-荷瘤小鼠为模型，在小鼠肿瘤部位原位注射和另一侧肌肉注射TMG纳米颗粒，采集注射前后不同时间点小鼠PA图像。以注射前小鼠为对照，此时肿瘤部位PA图像呈蓝色，表明PA信号强度很弱。与对照组相比，在0.5~2 h，肿瘤部位颜色逐渐由蓝色变为深红色，然后在10~24 h红色逐渐褪去，表明PA信号强度在0.5~2 h之间增加，这是由于肿瘤部位的TMG纳米颗粒与GSH响应，释放更多的TiO_2-x并在2 h达到最高值。

根据上述体内肿瘤微环境激活的PA成像结果，使用TMG纳米颗粒作为PA探针，用于跟踪肿瘤发育过程中肿瘤的生长。监测了4、6、8、10、12和14天的肿瘤生长。首先注射TMG纳米颗粒到肿瘤中，并在2小时后记录PA信号。结果显示（图19），PA信号强度随着肿瘤体积的生长逐渐增大。在最初的8天中，PA信号相对较低，但是从第8天到第14天，信号明显增强。这是由于肿瘤发育过程中GSH水平的波动。这些发现表明GSH水平与肿瘤生长相关，制备的TMG纳米颗粒可以用作肿瘤微环境激活的PA探针以监测肿瘤的生长。

图20. 不同时间(天)在肿瘤部位局部注射TMG纳米复合物后获得的PA图像和相应天数的光声强度。

为了评价采用TMG纳米颗粒治疗肿瘤的效果，将4T1荷瘤小鼠随机分为7组，分别为对照组、PBS+Laser、MONs、GOx、TiO_2-x@Cu,S-MONs、TMG和TMG+Laser组。含有激光的光照组根据体内成像结果，于原位注射2 h后进行激光照射。如图20a-b所示，与对照组和PBS+Laser光照组相比，其它五种处理组均表现出一定的肿瘤生长抑制。为了评估抗肿瘤效果，在16天的治疗期间连续测量并记录肿瘤体积，结果如图20c所示。在无或有激光照射时，作为对照，PBS组小鼠肿瘤体积增加8倍以上，说明在没有激光照射的情况下，TiO_2-x@Cu,S-MONs纳米颗粒组小鼠的肿瘤生长与MONs或GOx组小鼠相似，而TiO_2-x@Cu,S-MONs纳米颗粒组小鼠的肿瘤生长较对照组缓慢，说明TiO_2-x@Cu,S-MONs纳米颗粒具有抑制作用，TMG纳米颗粒通过CDT具有一定的抗癌作用。重要的是，根据肿瘤相对体积随时间的变化，在1064 nm激光照射下TMG纳米颗粒小鼠在整个治疗期间几乎完全抑制了肿瘤的生长，肿瘤抑制率接近100%，表明CDT/PTT协同治疗的疗效优于单独治疗。

根据治疗期间荷瘤小鼠体量记录结果（图20d），CDT/PTT协同治疗使肿瘤几乎完全消融而没有复发。此外，所有小鼠在整个实验期间没有表现出明显的体重减轻（图6d），这意味着所有治疗没有明显的副作用。表明TMG纳米颗粒具有很好的治疗效果和良好的生物安全性。

图21. (a) 不同处理治疗后16天小鼠代表性照片；(b) 小鼠解剖肿瘤数码照片：1. Control；2. PBS+Laser；3. MONs；4. GOx；5. TiO_2-x@Cu,S-MONs；6. TMG；7. TMG+laser；(c) 16 天治疗期间肿瘤体积随治疗时间（天）的变化曲线；（d）16天治疗期间小鼠体重随时间的变化曲线。 

（3）发展了一种用于羟基自由基体外检测和体内成像的圆二色和光声双模探针

该探针以手性D/L-半胱氨酸和钼酸盐为原料，根据金属离子与巯基的相互作用，形成具有手性性质的纳米复合物（Ox-POM@D/L-Cys）。在这种纳米复合物中，L-Cys与Ox-POM结合后，Ox-POM中的Mo⁶⁺被L-Cys还原为Mo⁴⁺。而在Ox-POM@L-Cys与•OH的反应过程中，部分Mo⁴⁺被•OH氧化成Mo⁵⁺，而中心Mo原子同时具有Mo^4+/5+的混合价态，而Mo⁵⁺的聚氧金属酸盐（POM）在NIR区域有强吸收，因此，Ox-POM@L-Cys可作为•OH的光声探针。另一方面，由于Ox-POM@D/L-Cys在可见光区的手性特征吸收具有CD谱特征，与•OH作用时，•OH破坏了直接连接Mo与巯基的键，导致Ox-POM@D/L-Cys由手性变为非手性POM，从而导致CD信号的变化，并且CD信号强度与•OH的浓度呈良好的线性关系，因此，Ox-POM@L-Cys也可作为•OH的CD探针。该工作2022年以封面文章的形式发表在Analytical Chemistry（Anal. Chem., 2022, 94, 2453−2464）上。

图22. 当期Analytical Chemistry 杂志的封面及方法原理示意图

利用该纳米探针，该课题组采用芬顿反应体系研究了Ox-POM@L-Cys探针对•OH的CD响应。使用Ox-POM@L-Cys作为•OH的PA探针，并使用PA成像技术评估了不同剂量的对乙酰氨基酚（APAP）引起的肝损伤程度。首先，将三组健康小鼠腹腔注射不同剂量的APAP (100、200、300 mg/kg)。每组小鼠给药APAP 6小时后，在小鼠腹腔注射100 μL Ox-POM@Cys探针溶液，1 h后各组进行PA成像。结果如图21所示，当APAP的剂量为100 mg/kg时，肝脏中仅存在微弱的PA信号。随着APAP剂量的增加，小鼠肝脏的区域逐渐增加，PA信号的强度逐渐增加。这些结果表明，APAP剂量越高，小鼠肝脏损伤越严重，证明使用本研究开发的Ox-POM@L-Cys探针，通过原位PA成像可以快速视觉诊断药物诱导的急性肝损伤。

图23. (a) 注射不同剂量APAP后小鼠肝脏部位的PA成像图。(b) 注射不同剂量APAP后小鼠肝脏部位的平均PA信号强度。(c) 注射不同剂量APAP 12 h后，小鼠血清ALT和AST水平。(d) 注射不同剂量APAP 12 h后，小鼠肝脏组织的切片图 (H&E染色)。

基于Ox-POM@L-Cys探针具有显著的•OH消耗能力，它可以有效地促进受损肝组织的再生，恢复肝功能。因此，该纳米探针也可以作为治疗肝损伤的纳米药物。当纳米探针进入受损的肝组织后，纳米探针与内源性•OH的氧化还原反应导致•OH耗尽，从而减少了•OH对肝组织的损伤，实现了对肝损伤的有效治疗。为了评价Ox-POM@L-Cys治疗肝损伤的效果及采用PA成像跟踪肝功能恢复过程的能力，小鼠每天口服Ox-POM@Cys（10 mg/kg）用于治疗药物性肝损伤（DILI），每隔一天对肝脏进行PA成像。DILI小鼠模型的建立、PA成像跟踪和治疗效率评价的过程如图22所示。经过不同的治疗时间后，向小鼠腹腔注射一定量的Ox-POM@L-Cys水溶液进行PA成像，跟踪肝功能恢复过程。结果表明，治疗过程中肝脏区PA信号强度逐渐降低，7天后基本恢复正常。

图24. (a) 使用Ox-POM@Cys探针监测小鼠肝损伤恢复过程的示意图。(b) 口服Ox-POM@Cys（10 mg/kg）用于治疗DILI小鼠后，不同时期小鼠肝脏部位的PA成像图。(c) 与 (b)对应的PA信号强度值。(d) 用Ox-POM@Cys治疗后不同时间段的DILI小鼠的血清AST和ALT水平。(e) 不同时间段用Ox-POM@Cys治疗的DILI小鼠肝脏切片的H&E染色图片。

导师介绍

赵书林

https://www.x-mol.com/university/faculty/9780