肝脏组织工程是一个充满前景的领域，为肝脏替代疗法提供了无限可能。制约肝脏组织工程发展的一个重要因素在于很难构建对肝细胞基质及其与肝细胞结合具有组织特异性的仿生材料，这需要综合考虑肝脏复杂的细胞组成和基质结构特性 ^[1]。能够复制肝脏杨氏模量和肝小叶多孔结构的仿生肝脏材料可以支持与天然小叶结构相似的肝细胞的生长和排列，并调节与肝细胞功能相关的信号通路 ^[2]。

目前多孔结构可以通过多种方式来设计和实现，例如溶剂浇铸、气体发泡、冷冻干燥、3D打印和相分离^[3-6]。然而，这些方法仍然具有一定的局限性，包括控制孔径和连通性方面的挑战、机械性能不匹配、生物相容性低以及合成程序不可扩展。在本研究中，受肝脏微观结构的启发， 实现了具有类似于肝小叶的互连大孔结构的仿生肝脏材料的设计和制造，用于肝细胞的功能维持。

肝细胞的在体微环境决定了肝细胞的活性及功能的表现。体外维持肝细胞的功能是肝组织工程和生物人工肝领域的重大挑战，因为这些肝细胞在分离后会迅速失去代谢和功能特征。受天然肝组织中发现的大孔结构的启发，作者开发了合成水凝胶支架，通过聚乙二醇（PEG）和多糖之间的相分离来模仿肝脏的结构组织，从结构方面构建了仿肝细胞细胞外基质的大孔水凝胶材料。该水凝胶表现出互连的大孔结构和适当的机械性能，表现出与脱细胞肝类似的微结构，提供了有利于肝细胞粘附和大量聚集体形成的最佳微环境，避免了肝细胞的失巢凋亡，确保了肝细胞的高存活率。该水凝胶可以维持细胞活性和功能高达至少14天，而二维培养导致细胞死亡，通过广泛地对比肝细胞存活和功能的一些重要信号通路发现，基于此种水凝胶三维培养的肝细胞在长达30天的培养周期后仍然维持着与培养之前相类似的基因表达水平。蛋白质测序数据进一步证实了在我们的水凝胶中培养时肝细胞之间细胞间相互作用的建立。值得注意的是，这些肝细胞维持了与新鲜分离的肝细胞非常相似的蛋白质表达谱系，特别是在Notch和TNF信号通路中。本研究的结果表明大孔水凝胶是肝组织工程有吸引力的支架，所构建的组织特异性肝细胞ECM仿生材料具有重要的应用前景。

图1 原代肝细胞分离、水凝胶制备和水凝胶中培养的细胞的示意图。(a) 肝小叶是肝组织的基本组成部分。肝细胞是肝脏的主要实质细胞。(b) 通过将PEG和葡聚糖以一定的组成混合，观察到相分离现象。(c) 使用紫外线触发聚合来固定水凝胶中的相分离。通过透析除去葡聚糖和未聚合的单体。（d）将（a）中分离的肝细胞加载到水凝胶中。(e) 葡聚糖、丙烯酰胺和4ArmPEG-丙烯酰胺的结构。(f) 肝细胞在相分离水凝胶中聚集并建立细胞-细胞接触。

图2 天然肝脏的复杂多级结构水凝胶仿生材料 （a）该水凝胶提供了有利于肝细胞粘附和大量聚集体形成的最佳微环境，避免了肝细胞的失巢凋亡，确保了肝细胞的高存活率。（b）该水凝胶可以维持细胞活性和功能高达至少14天，而二维培养导致细胞死亡（c）此种水凝胶三维培养的肝细胞在长达30天的培养周期后仍然维持着与培养之前相类似的基因表达水平。

顾晓松, 中国工程院院士，先进生物材料和医疗器械全国重点实验室主任，国际组织工程神经转化医学的开拓者。几十年以来深耕于组织工程再生医学的创新与产业发展， 近年来，聚焦于国家面向2035再生医学创新与产业发展战略研究-组织工程复杂器官构建。首次科学系统创新的将组织工程器官（组织）构建三大基本要素拓展为五大基本要素，即：可降解材料、干细胞或支持细胞、生长因子或细胞因子、细胞基质和再生微环境， 首倡基于五大基本要素从源头创新研究组织工程复杂器官构建, 以五大基本要素创新理论为指导，组建国内、国际该领域顶尖专家学者，组成强大的人才团队和创新研究机构， 通过干细胞再生医学和组织工程化手段在体外构建具备一定功能的器官或包含多组织相互作用的复杂结构。如肝脏、胰腺、肾脏等复杂器官和周围神经、脊髓、类脑等部分复杂结构，实现复杂器官的体外制造及相关生物（细胞）治疗技术转化，以显著提高我国再生医学和组织工程源头创新和集成创新能力。 

顾晓松院士济南实验室课题组， 是基于新型创新研究机构(济南微生态生物医学省实验室)平台，主攻方向为通过颠覆性创新技术研究， 依据组织工程器官构建五要素理论， 解决组织工程肝脏构建的世界性难题，构建出部分有功能或全功能的组织工程类肝小叶/微小肝组织， 最终目标为长期的肝功能恢复提供可移植的类肝组织， 极大地推进再生医学和组织工程五大基本要素策略在治疗终末期肝病中的转化应用。

欢迎干细胞、生物材料、多模态传感、再生医学、组织工程和产业转化等领域的优秀PI、博士生、博士后等研究人员加入济南实验室组织工程肝脏课题组。

Sun Y, Yin S, Cui J, et al. Long-term functional maintenance of primary hepatocytes in vitro using macroporous hydrogels engineered through liquid-liquid phase separation. Nano Research, 2023, https://doi.org/10.1007/s12274-023-5940-3.

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